PCRDGGE技术在土壤微生物多样性研究中的应用.docx

PCR-DGGE技术在土壤微生物多样性研究中的应用1 研究背景土壤是微生物生命活动的重要场所，作为土壤的重要组成部分，微生物对土壤肥力的形成与植物营养的转化起着积极的作用。土壤中微生物种类、数量的变化及分布，既反应了土壤各因素对微生物种类及分布的影响和作用，也反应了微生物对土壤肥力、物质循环及能量转化的影响和作用，直接影响着土壤的肥力状况，揭示了土壤发育现状及趋势。土壤微生物多样性是生物多样性研究的一个重要领域，研究土壤里的微生物群落结构演替规律、微生物种群动态变化对于丰富现有微生物菌种资源，保持地球微生物物种的多样性及土壤的可持续利用都具有重要意义，是当今国内外关注和研究的热点问题之一。定量和定性的描述土壤微生物多样性是微生物生态学的难题之一。长期以来，囿于研究方法的限制，人们多采用常规的分离纯化培养技术来研究土壤里复杂的微生物多样性，但是这些方法都存在着诸多不可避免的缺陷性，只能够培养出自然界里0．1％～1 0％的微生物，因此有关土壤微生物的多样性研究进展不大。近年来，随着分子生物学技术的不断发展，DNA指纹图谱技术被不断应用于土壤微生物多样性的检测，使得人们从基因遗传水平上去更深入、更广泛地认识土壤中微生物的多样性成为可能。变性梯度凝胶电泳技术(denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)是由Fischer和lerman于1979年最先提出的用于检测DNA突变的一种电泳技术。1993年MuZyer等首次将DGGE技术应用于微生物生态学研究，证实了这种技术在研究自然界微生物群落的遗传多样性和种群差异方面具有明显的优越性。由于DGGE具有可靠性强、重现性高、方便快捷等优点，短短的10年内，已经成为微生物群落遗传多样性和动态分析的强有力工具，被广泛用于土壤特殊微生物生理类群，自然环境条件下土壤微生物多样性变化，污染土壤，不同种植制度下的土壤以及转基因植物、微生物介入的土壤微生物多样性等方面的研究。2 材料与方法2.1 材料2.1.1 供试土样2.1.2 培养基细菌采用牛肉膏：5g；蛋白胨10g；NaCl 5g；琼脂 20g；水1000ml；pH7.0-7.2；121℃灭菌30min。2.1.3 主要试剂细菌DNA提取试剂：0.9%NaCl，TE缓冲液（50mM Tris-HCl，20mM EDTA pH 8.0），STE缓冲液（5M NaCl10ml，1M Tris-HCl 5ml，0.5M EDTA 1ml，dH2O 484ml），10%SDS，溶菌酶溶液（溶菌酶100mg，ddH2O 5ml，-20℃保存），PCl溶液（苯酚：氯仿：异丙醇 = 25：24：1），异丙醇，76%乙醇。土壤总DNA提取液（100mmol/L Tris-Hcl，100mmol/L EDTA，100mmol/L磷酸钠，1.5mol/L氯化钠，1%CTAB，pH8.0）扩增试剂及酶切试剂：BOXAIR引物和16S rDNA 以及土壤细菌，真菌扩增引物由上海生工合成，mixture及MspI、HinfI、HaeⅢ、TaqI酶均购自上海生物工程有限公司。电泳缓冲液：Tris 242g，0.5M EDTA 100ml，蒸馏水定容到1000ml，用冰醋酸调节pH约为8.3。溴化乙锭染色剂：溴化乙锭100mg，蒸馏水100ml。2.2实验步骤2.2.1 土壤总DNA的提取与纯化土壤总DNA提取方法参照Lian [92]的方法，并略加修改。将5g土壤样品与13.5mlDNA提取液混合。再在混合物中加入100μl蛋白酶K（10mg/ml）于225r/min的摇床上，控温37℃，30min后再加入1.5ml 20%SDS，水浴2h，每隔15-20min轻轻上下颠倒几次，最后在3000r，4℃下离心10min，收集上清液，转移到50ml离心管中。再加入4.5ml提取液和0.5ml 20% SDS于土壤沉淀中，充分混匀，65℃水浴2h，3000rpm离心10min，合并上清液。将上清液与等体积氯仿异戊醇（24：1）混合离心，吸水相转移至另50ml离心管中，以0.8倍异丙醇室温沉淀1h，9000rpm离心20min，收集沉淀，用70%乙醇洗涤沉淀，干燥后，溶于400μl无菌去离子水中，再采用上海生工的UNIQ-10柱式胶回收纯化试剂盒进行纯化土壤DNA样品，所得DNA溶液用1%的琼脂糖进行检测。2.2.2 PCR扩增由于巢式PCR反应有两次PCR扩增，从而降低了扩增多个靶位点的可能性（因为与两套引物都互补的引物很少）增加了检测的敏感性；又有两对PCR引物与检测模板的配对，增加了检测的可靠性。因此，采用巢式PCR进行扩增。细菌的引物见表1。表1 PCR扩增各类微生物的引物序列[93-96]PCR次序引物primer序列(5-3)