二维电泳详细过程材料.doc

北京六一仪器厂DYCZ-26C双向电泳系统检测报告 技术部 吴承疆 QQ 实验原理： 双向电泳是一种分析从细胞、组织或其他生物样本中提取的蛋白质混合物的有力手段，已得到广泛应用。这项技术利用蛋白质的两种特性，分两步将不同的蛋白质分离。 第一向步骤为等电聚焦（IEF），即根据蛋白质的等电点（pI）差异将蛋白质分离。第二向步骤为十二烷基硫酸钠- 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS），即利用蛋白质的分子量（Mr, 相对分子量）差异将蛋白质分离。双向凝胶电泳结果中的每个斑点都对应着样本中的一种蛋白。因此，可将上千种不同的蛋白质分离开来，并得到每种蛋白质的等电点、表观分子量等信息。 实验方法： 一.实验材料: 1.主要仪器和试剂（sigma,Ampholine购自GE） 主要试剂 超纯水（MiLiQ）、尿素、硫脲Thiourea)、Dithiothreitol，DTT、CHAPS、(Iodoacetamide，IAASodium Dodecylsulphate，SDS溴酚蓝Bromophenol Blue)、低熔点琼脂糖、过硫酸铵(Ammonium Persulfate APS)、TEMED（四甲基乙二胺）、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺；Tris碱、甘氨酸、硝酸银、无水碳酸钠、无水乙酸钠、硫代硫酸钠、甲醛、无水乙醇、冰醋酸、氢氧化钠、磷酸、甘油（丙三醇 glycerin ）、牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA）、蛋白质marker、蛋白定量试剂盒 主要仪器 DYCZ-26C、DYY-16D、DYY-6D、高速离心机紫外分光光度计超声波破碎仪Millipore纯水仪(法国Eppendorf普通离心机UMAX扫描仪台湾；摇床pH计 尿素 8M 4.805g CHAPS 4% 0.4g DTT 65mM 0.098g（现加）每小管5毫克 2%Ampholine （40%） 0.5 ml（现加） 每小管25微升 溴酚蓝 0.001% 10μl （1% 溴酚蓝） MilliQ水 定容至10ml ，分装成20小管，每小管500uL，-20℃冰箱保存 样品覆盖液（含8 mol/L尿素，1% Ampholine） 取4.8g新鲜尿素（超纯），0.3 ml Ampholine，用去离子水定容至10mL，分装，每管含有100 uL，置于-20℃冰箱内保存。 胶条平衡缓冲液母液 尿素 6M 36g SDS 2% 2g Tris-HCl 0.375M pH8.8 25ml（1.5M pH8.8 Tris-HCl） 甘油 20% 20ml MilliQ水 定容至100ml 分装成10管，每管10ml，-20℃冰箱保存。 胶条平衡缓冲液I 胶条平衡缓冲液母液 10ml DTT 0.2g 充分混匀，用时现配。 胶条平衡缓冲液II 胶条平衡缓冲液母液 10ml 碘乙酰胺 0.25g 充分混匀，用时现配。 低熔点琼脂糖封胶液 低熔点琼脂糖 0.5% 0.5g Tris 25mM 0.303g 甘氨酸 192mM 1.44g SDS 0.1% 1ml（10% SDS） 溴酚蓝 0.001% 100μl（1%溴酚蓝） MilliQ水 定容至100ml 加热溶解至澄清，室温保存。 第一向聚丙烯酰胺凝胶储液 丙烯酰胺 7.09g 甲叉双丙烯酰胺 0.405g MilliQ水 溶解后定容至 25 ml 第二向30% 聚丙烯酰胺贮液 丙烯酰胺 150g 甲叉双丙烯酰胺 4g MilliQ水 溶解后定容至