克鲁维酵母乳糖酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达材料.doc

河北农业大学 本科毕业论文（设计） 题 目 ：克鲁维酵母 学 院：品科技学院 学生姓名： 专 业： 班级学号：010244020114 指导教师姓名： 指导教师职称： 二O一四年 六 月 日 克鲁维酵母河北农业大学食品科技学院 河北保定071000乳酸克鲁维酵母Cloning and Expression of Lactase from Kluyveromyces lactis in Pichia pastoris Wang Xiang (College of Food Science and Technology, Agricultural University of Hebei, Baoding 071000) Abstract :The principle of the study is that the lactase can be used for treatment of lactose intolerance and production of low-lactose milk. DNA sequences of lactase from Kluyveromyces lactis were isolated by PCR and RT-PCR methods in the thesis. And after a serious process the lactase gene was cloned into pPIC9K and constituted the recombinant vector of pPIC9K-lac. Key words: lactase; cloning; Pichia pastoris; expression 1 前言 1.1 乳糖酶的简介及问题 众所周知，乳及乳制品是人类改善营养、增强体质的理想食品。牛乳中含有5%左右的乳糖，我国人群中有很大一部分人（约75%~95%）患有乳糖不耐受症，严重影响乳及乳制品的推广。因为乳糖酶能将乳制品中的乳糖水解为半乳糖和葡萄糖，利用乳糖酶生产低乳糖制品或口服酶制剂，从而有效解决“乳糖不耐症”问题。 乳糖酶Lactase)，系统名为?-D-半乳糖苷半乳糖水解酶(?-D-galactoside galactohydrase, EC 3.2.1.23)简称?-半乳糖苷酶(?-galactosidase)[1]。它是一类催化特殊类型的糖苷键?-半乳糖苷类化合物中?-半乳糖苷键发生水解断裂的酶。该酶能将乳糖水解为半乳糖和葡萄糖，并具有半乳糖苷的转移作用，在乳糖分子的半乳糖一侧连接1~4个半乳糖，生成低聚半乳糖galactooligosaccharide，GOS[2]。乳糖酶广泛存在于细菌、酵母菌和霉菌中。不同来源的乳糖酶，其酶学性质相差很大[]。乳糖酶根据不同来源可分为胞内本系酶或胞外酶，如乳酸酵母、黑曲霉、米曲霉、米根酶等产乳酸均为胞外酶，脆壁克鲁维酵母和大部分细菌产胞内酶。乳糖酶广泛存在于植物、动物肠道、细菌、真菌及放线菌中。不同来源的乳糖酶催化反应的最适温度和最适pH都有所差别。最适pH值：由大肠杆菌（E.Coli）制得者为7.0～7.5；由酵母菌制得者为6.0～7.0；由霉菌制得者为5.0左右。最适作用温度为37～50℃。在正常使用浓度下，72h内约可使74%的乳糖水解。乳及乳制品含有丰富的优质蛋白质、脂肪、碳水化合物以及几乎全部已知的维生素和多种矿物质，尤其是钙含量高，钙磷比例适当，易被人体消化吸收，还含有免疫球蛋白等抗病因子，所以乳及乳制品有“近乎完美的食物”的美称，是人类改善营养、增强体质不可缺少的理想食品牛乳中含4.7%~5.0%的乳糖，是乳中最主要的碳水化合物，占其总糖量的98%以上，是牛乳能量的主要来源国人群中有很大一部分患有乳糖不耐症亚洲人和非洲人的发生率达75%~100%。我国汉族成人乳糖酶缺乏的发生率高达75%~95.7%，3~13岁儿童乳糖酶缺乏发生率为 87%，儿童乳糖酶下降的年龄在7~8岁。乳糖不耐症的存在很大程度上限制了人们对乳及乳制品的摄入，会产生一系列不良影响。其长期危害在儿童易表现为钙吸收不良、腹泻、软骨病、体重低下及生长发育迟缓，在老年人尤其是老年妇女易表现为骨质疏松等症状。患者除了出现腹泻、肠梗塞和胀气等现象，还会造成肠道蠕动加快，减少蛋白质和无机盐的营养吸收[]。用乳糖酶水解牛乳或乳制品中的乳糖，生产低乳糖制品（如乳糖水解乳、低乳糖奶粉等）可以