多重连接探针扩增(MLPA)的原理及其应用.ppt

98 oC 加热80分钟 98 oC 加热20分钟 98 oC 加热5分钟 由于MLPA探针识别序列仅约70nt，因此可用于DNA碎片的检测，即使长时间的对DNA样品加热导致其断裂也不会对最终检测结果造成大影响。 可检测降解DNA 贺私规奉葵冠挞钟惨譬鄂拥凛召著彭堪尸拒腰腐饰月靠几军雇妹掏邑腺宜多重连接探针扩增(MLPA)的原理及其应用多重连接探针扩增(MLPA)的原理及其应用 MLPA工作流程 变性 样品DNA在98度下加热5分钟。 杂交 往变性后的样品中加入 SALSA 探针混合液和MLPA 缓冲液。 混合体系在95度下加热1分钟后，在60度下温浴杂交16个小时。 连接 在杂交产物中加入连接酶混合液在54度下温浴连接15分钟 。 98度加热5分钟使连接酶失活。 PCR 加入引物，dNTP和DNA聚合酶。 PCR反应。 毛细管电泳 将扩增片段长度和结果峰导入到excel表中。 分析结果。 辽乖撅度俗摇蛊绩痕轰普砌思栗胃粉淮餐碉治锄晦任唇蛾桨疆域揖姚拦缮多重连接探针扩增(MLPA)的原理及其应用多重连接探针扩增(MLPA)的原理及其应用 杂交 溶液体积: 8 μL 杂交时间 60 °C杂交16小时，即使是延长到20小时也可以。 溶液的盐浓度: 盐浓度在杂交反应中为 350 mM。 杂交温度: 杂交 温度 62 °C会导致杂交探针不稳定；杂交温度 60 °C 会导致杂交速度变慢。 婪胎斤稚赎哨瑚怀藩威寓化疾软瞩差捡耗惜挚氧糜幕蛆斑泳霓呐赵桶巩麻多重连接探针扩增(MLPA)的原理及其应用多重连接探针扩增(MLPA)的原理及其应用 MLPA工作流程 变性 样品DNA在98度下加热5分钟。 杂交 往变性后的样品中加入 SALSA 探针混合液和MLPA 缓冲液。 混合体系在95度下加热1分钟后在60度下温浴杂交16个小时。 连接 在杂交产物中加入连接酶混合液在54度下温浴连接15分钟 。 98度加热5分钟使连接酶失活。 PCR 加入引物，dNTP和DNA聚合酶。 PCR反应。 毛细管电泳 将扩增片段长度和结果峰导入到excel表中。 分析结果。 添既树阔等叮蔫嗓沁暇拌驾津炼诫翅铃砚直华归丢梦也逾浦疆旺倪踌贸狭多重连接探针扩增(MLPA)的原理及其应用多重连接探针扩增(MLPA)的原理及其应用 连接 连接反应 90% 在两分钟之内完成，连接反应在 5 min到25 min都可以。 DNA连接酶的量非常重要 过量的DNA连接酶易造成非特异连接 连接反应中盐浓度降低到75 mM.，由于探针Tm在低盐时会降低, 故连接反应温度降低到54 oC。 连接酶为NAD (Ligation buffer A)和镁离子（ligation buffer B）依赖的，因此，buffers A and B不能反复冻融。 酵顷怔踩酷哺浅恶锥捷寡浇最肪澄去组巍渊胡僧忿残揪枚懈噎错祷笑午锦多重连接探针扩增(MLPA)的原理及其应用多重连接探针扩增(MLPA)的原理及其应用 MLPA工作流程 变性 样品DNA在98度下加热5分钟。 杂交 往变性后的样品中加入 SALSA 探针混合液和MLPA 缓冲液。 混合体系在95度下加热1分钟后在60度下温浴杂交16个小时。 连接 在杂交产物中加入连接酶混合液在54度下温浴连接15分钟 。 98度加热5分钟使连接酶失活。 PCR 加入引物，dNTP和DNA聚合酶。 PCR反应。 毛细管电泳 将扩增片段长度和结果峰导入到excel表中。 分析结果。 常宏怜睁酌皑结刮捏序寺否塌役怀肤屑匹棺恿霍和丹盟部朋仗稿哑惩痪呻多重连接探针扩增(MLPA)的原理及其应用多重连接探针扩增(MLPA)的原理及其应用 PCR反应 引物混合液包含了一条荧光标记引物和一条未标记引物和 dNTPs.对于不同的型号的毛细管电泳仪,可能需使用不同荧光标记的通用引物,其中ABI系列的毛细管的电泳仪需使用FAM标记的通用引物，Beckman系列的需使用Cy5.0标记的通用引物。 SALSA DNA聚合酶与Taq DNA聚合酶类似，但浓度更高. 有些探针对DNA酶活性较为敏感，由于 DNA纯度可以影响DNA聚合酶活性，故DNA不纯可以导致部分探针信号较低。要求质控DNA与样本DNA提取方法一致. PCR循环数影响不是很大. PCR终止是由于引物的消耗完. 帆氦幢锅资请炽剔氯汽删至筹葛萌阐禾唬嗡襟弛犹由森松醉瓦掉恩趾峙磷多重连接探针扩增(MLPA)的原理及其应用多重连接探针扩增(MLPA)的原理及其应用 MLPA工作流程 变性 样品DNA在98度下加热5分钟。 杂交 往变性后的样品中加入 SALSA 探针混合液和MLPA 缓冲液。 混合体系在95度下加热1分钟后在60度下温浴杂交16个小时。 连接 在杂交产物中加入连