5’-RACE技术的意义可以精确定位转录起始位点.docVIP

5’-RACE技术的意义：可以精确定位转录起始位点。但是定位转录起始位点又有什么意义呢？以RNA聚合酶Ⅱ为例，启动子区一般位于转录起始位点上游200-300bp的范围内，也即转录起始位点的确定有助于分析基因的转录。而且有些基因具有多个转录起始位点，通过5’-RACE技术可以精确定位之，进而详细研究基因的调控机制。 5’-RACE试剂盒一般基于以下几种技术：SMART、Oligo capping method、self-ligation和anchored PCR。下面将分别介绍这些技术的原理和各自的优缺点。 1、SMART技术。该技术是基于以下两个观察发展起来的：a、不同反转录酶包括MMLV合成的cDNA 3’端保真度不高；b、不同的反转录酶具有不同的加尾特性，MMLV特意的在cDNA末端加上3-4个dCTP。该技术用MMLV合成cDNA第一链，同时利用它的加尾特性在合成的cDNA链3’加上3-4个dCTP，而且当帽子结构存在时该酶的加尾活性最高（对全长分子的富集机制），随后这3-4个碱基与体系中事先加入的引物（该引物的3’端有3-4个dGTP）配对，MMLV继而以聚合酶活性将配对引物补成双链。目前基于该技术的试剂盒只有Clontech公司生产，全名为SMART RACE cDNA amplification kit（Cat634914）流程见图： 该方法的突出优点就是操作简便，成功率较高，全场分子的比例较高。cDNA第一链的合成和加尾一步即完成，避免了其他方法中对mRNA和cDNA链的反复操作，降低了mRNA降解和合成产物丢失的风险，使本来就含量甚微的全长分子得到最大保存，所以这种方法得到了广泛认可，应用最多。如果加上RNA提取时间，这种技术可以在3个小时内得到加上接头的cDNA产物，最大限度地降低了mRNA的降解风险。 2、Oligo capping method方法（又称RLM-RACE）是由日本东京大学铃木等人开发，可以更精确的定位转录起始位点。我们知道真核生物的mRNA具有一个3’尾巴和一个5’帽子结构，该技术正是利用5’端的帽子特性对全长分子进行富集和扩增。降解的mRNA5’端都有一个磷酸基，用碱性磷酸酶去掉该磷酸基，随后用烟草酸性焦磷酸酶去掉帽子结构，则全长分子的5’端会暴露出磷酸基，随后的连接步骤中锚定引物将特意的加在全长分子的5’端而不会和降解的分子连接（全长分子的富集机制）。目前基于该方法的试剂盒有TaKaRa（5’-Full RACE kit D315）和Ambion（Firstchoice RLM-RACE kit AM1700）两家都有生产，步骤如图： 该方法的最大优点就是全长分子的比率高，可以说只要是扩增产物就肯定是全长分子。但是该方法的最大缺点是操作复杂，而且都是针对mRNA分子进行操作，使mRNA分子降解的风险极大提高，所以成功率不是很高。对于新手和实验室条件较差者不推荐使用该试剂盒。 3、Self-ligation技术。基因特异性（或者OligodT）反转录合成cDNA第一链，RNase H降解杂合链中的RNA，连接酶连接纯化后的cDNA链，在已知片段上设计反向PCR引物进行未知片段的扩增。该试剂盒宝生物以前有售，现在已停产，原理如图： 该试剂盒想法十分好，但是由于没有全长分子的富集机制，得到全长分子的几率比较低。而且在实际使用中它的扩增片段都比较短，不能满足实验要求。 4、Anchored PCR方法。利用一条基因特异性反转录引物，在反转录酶的作用下合成cDNA第一链，将RNA-DNA杂合链中的RNA降解纯化后，利用末端转移酶在cDNA链的3’端加入PolyC尾巴（尾巴长度不能确定），然后利用abridged anchored primer和一条基因特异性引物扩增（可能需要巢式PCR才能得到结果）。该试剂盒有Clontech（Marathon cDNA amplification, Cat: 634913）和Invitrogen（5’RACE system for rapid amplification of cDNA ends, Cat: 18374-058）公司在售，操作简图如下： 该法最大的缺点是全长分子的比率较低，而且操作复杂，整个实验流程需要耗费超过一天的时间。这种方法没有像SMART和Oligo capping method中那样采取对完整分子的富集机制，所以它依赖于高质量的反转录酶（具有通读复杂二级结构的能力、具有较高的反应温度）和高质量的RNA，否则得到全长分子的几率会很低。