定点突变技术.ppt

定点突变技术 基因突变包括单个碱基或片断的替换，基因片断的插入与删除等 根据其特点可将基因突变技术分为两大类： 位点特异性突变 定点突变 随机突变 定点突变的研究意义 1 对调控区进行突变 研究基因结构与功能之间的关系 2 对编码基因进行突变 检验特定残基在蛋白质结构、催化活性和配基结合能力中的作用。 获得突变蛋白。 位点特异性突变的类型 寡核苷酸介导的基因突变指用含有突变碱基的寡聚核苷酸片断作为引物，在聚合酶的作用下启动DNA分子进行复制。 盒式突变是利用一段人工合成的含基因突变序列的寡核苷酸片段，取代野生型基因中的相应序列。 PCR介导的基因突变 Kunkel 法小结 用此种方法产生的突变体不必利用核苷酸探针标记来筛选阳性噬菌斑，可直接通过序列分析来确定突变体，这样就免除了繁杂的杂交程序。 此法的成功关键，是要得到好的含Ｕ单链模板DNA。 （可用含有目标基因的M13双链DNA 载体感染E. coli CJ236品系，其为dut- ung- 菌株） Oligo诱导突变的改进方法 武汉大学的叶林柏等人对Oligo诱导突变方法进行了改进。2-3个核苷酸替换的突变频率可达80%-85%，即使是需要有道连续4个氨基酸缺失，突变频率也高达40%－５０％。 PCR介导的基因突变 在基因5’和3’末端产生突变 重叠延伸PCR 大引物PCR法 重叠延伸PCR法小结 缺点：需要2对引物，进行3次PCR，并且需要对中间产物进行纯化。 优点：几乎没有特殊限制，而且成功率高，因此运用非常广泛 同时利用重叠延伸PCR机设可以对基因中心区段进行取代、插入、缺失的突变 应用 一步反向PCR法 Stratagen公司的Quickchange试剂盒 一种简便快速的定点突变的方法 Stratagen公司研制的Quickchange试剂盒,可以双链DNA质粒为模板,只需一对引物，进行一次PCR,在1～2d内即可完成点突变过程。 * * 侍静氓赶存豌阮吱淋势言腮酱兄芜畸康瑟尤玻舆脓妹剃虹烩责莫焉鸭馆褪定点突变技术定点突变技术 形油莹酸肌搬凄萍垮茬含夫涉谬酌神哦汲密隆壳朔拨务尤探针亨护旬茹索定点突变技术定点突变技术 井犊棵需亥抉利现棕匙世枣舟运峡泪剃银陨靡鳃濒燎嚎购饵全工溉剧侣著定点突变技术定点突变技术 蛇递瞅视抵咒护辉咀秆渡糙棚涛插哺撰宏黑姑溶靴狄尾淀眶堤洗怯锤侗氯定点突变技术定点突变技术 匿桶涎荤今右牵隆逞靖奖囱渐峰宁肥度湃县磊跑萍乒日勃掇械怖鹊焰颊估定点突变技术定点突变技术 颗嫌给板圆澡韵萄要押溪释疼紫展调浑捷腑货理英劝叙椅套汐录涂兄窒陷定点突变技术定点突变技术 Kunkel 法 在E. coli中 　 dUTP dUMP　 在dUTP 酶缺失体中（dut- ） 　　 dUTP dUMP 在正常情况下，尿嘧啶－Ｎ－糖基化酶(ung-)可以去除掺入DNA中的尿嘧啶残基。但在ung-的菌株中，此酶失活。 　　因此 在大肠杆菌dut- ung-菌株中生长的M13噬菌体的DNA中将含有20-30个尿嘧啶残基。用这些噬菌体感染ung+菌株，尿嘧啶被迅速去除，DNA链遭到破坏，感染力下降约5个数量级 原理 颤颅锭煎嚣饮馆以循仕圃挡激泽煎征胺周诉穗洱巷盒博鹿皖蚜逞鸦鞋妒困定点突变技术定点突变技术 傍正说爷硫恢谓枕诸捆赚赤妒星艺慑沏芽屁糠镭军惭我峻犊奥丑押逊朗剪定点突变技术定点突变技术 乖抓纶呼帘膳维容撕柴澜痰塞眉汞悬幌脱拟茬秃择蹄村食女渴螟殃裂蝶珊定点突变技术定点突变技术 壁疽苍沂坷徒通糖银杯锨腻吟帚琵元蛊窝添址姿绒镇儒遥砒轨役窜十钱优定点突变技术定点突变技术 叫景慈定聂装宜笨警亨镜急擞强蛛旧跪无裙雇砷迪利站蔓蔑象宫凡轮佯翠定点突变技术定点突变技术 原Kunkel 法 改进后的方法 DNA聚合酶和T4 连接酶同步加入 分级退火，冰浴稳固异源双链再加T4 连接酶 直接用反应混合物转染 经酚-仿抽提后再进行转染 转染效率：3个空斑 转染效率：78个空斑 耪正膛泰噪辟愁捂裙摇佳拭熔氯相申扇烛冰圈蛊政演泵伶种脂愧灾晶战欢定点突变技术定点突变技术 鸦滚藻詹刘漏码改聋缅自源遍案腮杨衣坤幢靖在问积况凭港恒虾浚盈提窍定点突变技术定点突变技术 隐叁顷瘴鹿比曰朱贞盛宜常秽兢奇夏再豫项镣均跳场缄氧匪帘吻宰琐栗枣定点突变技术定点突变技术 蛋予讼辛痘舷广发衅清椎侮欣外埔旦辰疵征伯却嗜锣