植物显微技术实验指导.doc

实验一 利用流动细胞仪测定植物DNA含量 一、实验目的 1、了解流动细胞仪的基本构造、原理与应用。 2、熟悉流动细胞仪的基本操作。 3、学会流动细胞仪样品制备及结果处理。 二、实验原理 单个细胞、细胞群或其他生物微粒经过特异的荧光染料染色（DAPI或PI或免疫荧光标记）之后，在气体压力下，通过样品管引入到喷嘴内形成样品流，样品流经过激光束（488、405等）照射，样品流中的细胞吸收光能后发射出荧光，然后经相应的检测器检测，检测结果以直方图、二维散点图或三维立体图的形式显示出来。根据荧光强度与胞内生物大分子含量的比例关系，对细胞进行定量分析。 三、实验步骤 1、从野外取新鲜幼嫩的叶片（或竹笋） 。 2、将新鲜的叶片（或竹笋）切取1平方厘米大小，放进干净玻璃培养皿中。 3、加入500μL PARTEC公司流式细胞仪自带的cystain UV precise P Nuclei Extraction Buffer滴于样品上。 4、用双面刀片将样品剁碎，核提取2-3分钟。 5、然后再加入2mL 仪器自带的cystain UV precise P stain Buffer进行细胞核染色，染色4分钟后。 6、利用移液枪吸取染色后的样品，经公司自带的滤膜过滤到5mL的测量管中，进行测量。 四、结果与分析 水稻平均峰值25.25，用所测竹种的数值除以水稻平均峰值25.25就是该竹种的DNA含量所对应的DNA含量。水稻（2C=1pg） 获得类似下图结果 实验二 石蜡切片技术 一、实验目的 在有关植物胚胎发育和组织器官的形态建成研究的过程中，都需要应用到石蜡切片技术。在植物杂交育种、作物病虫害防治、药用植物的培育和鉴别，以及林木材性鉴别等方面的研究和教学工作中，由于各作物器官的性质差异以及研究目的的不同，就需要用不同的制片方法。开展本实验，要求学生熟悉石蜡切片从材料固定到材料观察分析的整个石蜡切片的全过程。 二、实验步骤 1、取材与固定植物脱水 材料其中含水，水与石蜡不能混合，必须去。去水用酒精，材料由酒精中，不能操之过急，须由低度酒精渐至高度酒精。通常由30％、50％、70％、80％、90％，每次须经2h，材料大的，时间须延长。若暂时不能埋蜡、材料可放在70％酒精中保存。在高度酒精中，不能过久．因酒精能使材料硬化，过久则材料由硬而脆，切时易于粉碎。 材料→25%酒精→35%酒精→50%酒精→70%酒精→85%酒精→95%酒精→100%酒精1→100%酒精2，每级2h 3、透明 材料脱水后，材料中全含酒精，酒精与蜡也不能混合，仍须除去。脱酒精通常用二甲苯，材料由酒精入二甲苯，最好也渐进行，先经纯酒精二甲苯混合液，再入纯二甲苯中，纯二甲苯须换一、二次才行。时间每次约1.5 h。二甲苯不仅脱去酒精，并且透明，所以又叫透明剂。每级停留时间视不同材料而定，一般液体容易渗入的材料时间可短，难渗入的可长，不能过长，以防止材料硬化。 100%酒精→2/3酒精+1/3二甲苯→1/2酒精+1/2二甲苯→1/3酒精+2/3二甲苯→100%二甲苯1→100%二甲苯2，每级1.5h。浸蜡倒去部分二甲苯，将材料和少量二甲苯转入35℃恒温箱中，逐渐向装有材料的烧杯中加入碎蜡，12h后更换为纯蜡，同时将恒温箱温度调到58℃，然后每4h更换一次纯蜡，共换3次后静置12h即可包埋。埋蜡 埋蜡是把材料封埋在石蜡里面，便于切片。材料封埋后，不仅材料外面包着蜡，材料面所有空隙也都充满着蜡。这样，材料的各部分都能保持原来的结构与位置，切片不致发生破裂或其他变形。所用石蜡，质地必须纯净透明，溶点通常在48～56℃这个范围内，以52℃的石蜡用得更多。在材料不硬，天气不热时，宜用较低熔点的蜡。材料硬，天气热的情形下，宜用高溶点的蜡石蜡选定后，将石蜡切成小块，置瓷皿中加热溶蜡，待石蜡近于全部熔化时，置于温箱中。在进行封埋的全部过程中，石蜡的温度，总以高于溶点2℃为宜，过低石蜡凝固，过高伤害材料。切片粘片将含有材料的蜡块修整为长方体，材料处于一端。 安装切片刀，刀的斜度，非常重要，最好先切除的蜡块试刀，以确定刀的斜度，一经调度适合后，就不要随便变动，以免每次试刀的麻烦。3）修整蜡块，刀片斜度调好后，将刀片移近蜡块，使小蜡块的下边与刀锋平行，然后把它固定，再转下蜡块．呈矩形才行。只有平整的蜡块，才能切出平整的蜡带。最后根据需要，调整控制切片厚度的机制。调度后，把它固定下来。上述四步骤完成后，就可进行切片，将切出的蜡带，平展于盒内以供粘片。 粘片时，以记号笔在载玻片上编号,滴加1或2滴1%明胶溶液，用胶头滴管将溶液涂匀滴加1或2滴展开剂然后将切好的蜡带平整地放置在溶液上,置烤片机上的烘片台上，使切片展开烫平，材料不现皱纹为度，烤片温度为42℃。1~2min