测pNPX酶活.doc

3.2.5 与酶活测定相关的储备液及缓冲液 PCbuffer：50mM phosphate,12mM citratepH7.0 DNS试剂的配制： ⑴取20.8g氢氧化钠溶于260ml蒸馏水中。 ⑵取6g3，5-二硝基水杨酸加入到⑴中氢氧化钠溶液中，加热溶解并混匀。 ⑶取182g酒石酸钾钠溶于500ml蒸馏水中。 ⑷取5g重蒸酚和5g无水亚硫酸钠加入到酒石酸钠的水溶液中。 ⑸将以上各步骤的溶液混合，定容至1L，置于棕色瓶中，暗处放置一周后即可使用。 1%羧甲基纤维素钠（CMC-Na）溶液：取1gCMC-Na溶于PCbuffer（pH7.0）100ml。置于4°C保存备用。 1%木聚糖溶液：1g木聚糖加入到100mlPCbuffer（pH7.0）5分钟，将所得木聚糖悬浊液10,000×g离心5分钟，弃沉淀后得木聚糖溶液4°C保存备用。 1mMpNPC溶液（10ml）：分别称取4.6mgpNPC和1.8mg葡萄糖酸内酯，溶于10mlPCbuffer（pH7.0）4°C保存备用。 1mMpNPG溶液（10ml）：称取3mgpNPG，溶于10mlPCbuffer（pH7.0）4°C保存备用。 1mMpNPX溶液（10ml）：称取2.7mgpNPX，溶于10mlPCbuffer（pH7.0）°C保存备用。 Tris-HCl（50mM，pH9.0）：取0.605gTris溶液适量蒸馏水中，调节pH值至9.0后定容至100ml，4°C保存备用。 3×gelbuffer：3MTris-HCl,0.3%SDS,pH8.5。 染色液，脱色液，电泳缓冲液配方参考Takara目录。 木聚糖酶活性胶复性buffer：25mMTris-HCl,0.1%TritonX-100pH7.0。木聚糖酶活性胶染色buffer：1%刚果红染色液。木聚糖酶活性胶脱色buffer：1MNaCl 5.2.12.4目的蛋白酶促反应动力学参数的测定 目的蛋白的米氏常数Km值和最大反应速率Vmax的测定采用Lineweaver-Burk作图法。将底物用PC buffer 配制成不同的浓度，测定等量的纯酶与不同浓度的底物，在最适温度反应30 min 内形成的还原糖，分别计算出反应速度V。以1/[S]为横坐标、1/V 为纵坐标作图，得到一条直线，其横轴截距为-1/Km，纵轴截距为1/Vmax(最大反应速度)，斜率为Km/Vmax，由此求出Km和Vmax。 4.2.8 目的基因的连接转化与鉴定 4.2.8.1 PCR 产物的纯化 PCR产物纯化实验步骤参照上海生工PCR产物纯化试剂盒说明书。 4.2.8.2 大肠杆菌感受态细胞的制备 ⑴ 新鲜培养的E. coli单克隆接种到50 ml经高温高压灭菌的LB培养基中，37°C，250 rpm过夜培养。 ⑵ 取4 ml过夜培养的E. coli菌液接种到400 ml LB培养基中（使用2 L三角瓶），37°C，250 rpm培养至OD600为0.375。 ⑶ 将⑵中培养的E. coli菌液分装至预冷的50 ml离心管中，并置于冰上5-10分钟。 ⑷ 3750 rpm，4°C离心菌液5分钟。 ⑸ 所得菌体沉淀重悬于10 ml预冷的CaCl2 buffer（60mM CaCl2，15%甘油，10 mM PIPES，pH 7.0，0.45 μm滤膜过滤除菌）。 ⑹ 3250 rpm，4°C离心菌液5分钟，所得菌体沉淀重悬于10 ml预冷的CaCl2 buffer。 ⑺ 重悬的细胞置于冰上放置30分钟。 ⑻ 3250 rpm，4°C离心菌液5分钟。 ⑼ 所得菌体沉淀重悬于2 ml预冷的CaCl2 buffer。 ⑽ 分装⑼中所得的感受态细胞至预冷的无菌EP管中，每管300 μl，每个反应可使用100 μl。分装后置于-80°C保存备用。 4.2.8.3 目的基因与表达载体的连接 所用表达载体为pEASY-E1。连接反应过程如下： ⑴ 纯化后的PCR产物1 μl(转入BL21时加0.5uL)加入到1 μl pEASY-E1载体溶液中，轻轻混合，室温反应20分钟。 ⑵ 加连接产物于50 μl刚刚解冻的感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴30分钟。 ⑶ 42°C准确热激30秒，立即置于冰上。 ⑷ 加入250 μl平衡至室温的未加Amp的LB（或SOC）培养基，200 rpm，37°C培养1小时。 ⑸ 4000 rpm离心1分钟，弃部分（100uL）上清后，保留约200 μl，轻轻悬浮菌体，取全部菌液涂板（Amp加三倍）。37°C培养过夜。 4.2.8.4 阳性重组子的筛选与鉴定 挑取单菌落划线于含氨苄青霉素的LB 平板培养基（Amp正常）上，于37°C恒温培养箱培养约16小时后挑取单克隆，置于10 μl无