15-脱氧-前列腺素J2对巨噬细胞移动抑制因子表达的影响.docVIP

15-脱氧-前列腺素J2对巨噬细胞移动抑制因子表达的影响 　　巨噬细胞移动抑制因子(macrophagemigrationinhibitoryfactor，MIF)是一种具有多种生物学功能的细胞因子，位于“炎症瀑布”的上游，可以调节炎性因子的产生和释放，通过自分泌或旁分泌方式发挥作用，促使巨噬细胞聚集在损伤区域。研究发现，15-脱氧-前列腺素J2(15-Deoxy-Delta;12，14-prostaglandinJ2，15d-PGJ2)能够在慢性肝损伤时抑制小鼠体内骨髓来源的单核巨噬细胞(bonemarrowderivedmonocyte/macrophage，BMM)向损伤区域募集，并能够抑制体外培养小鼠单核巨噬细胞的生物学功能，但其作用靶点尚未明确。本研究以小鼠单核巨噬细胞系J774A.1为研究对象，以MIF为靶分子，在体外脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导的炎症模型中探讨15d-PGJ2对MIF表达的影响及其机制。 　　材料和方法 　　材料 　　小鼠单核巨噬细胞系J774A.1(中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心细胞库);DMEM培养基(美国Invitrogen公司)，胎牛血清(德国Biochromag公司)，胰蛋白酶、beta;-巯基乙醇、青霉素/链霉素(美国GIBICO/BRL公司)，15d-PGJ2(美国AnnArbor公司)，LPS(美国Sigma公司);RNeasyMimiKit(德国Quagen公司)，M-MLV逆转录试剂盒(美国Invitrogen公司)，SYBRGreenPCRMasterMix，TaqmanUniversalPCRMasterMix(美国ABI公司);抗GAPDH单克隆抗体(美国CellSignalingTechnology公司)，抗MIF多克隆抗体、抗F4/80多克隆抗体、抗PPAR-gamma;多克隆抗体(美国SantaCruzBiotechenology公司)。 　　细胞培养 J774A.1接种于含10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素的DMEM培养液中，置于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养，接种密度1times;106/r=10cm细胞培养皿或3times;105/r=6cm细胞培养皿，细胞汇合到90%时进行传代，取对数生长期细胞进行实验。 　　细胞的药物处理 细胞汇合到80%时给予药物处理。细胞饥饿12h，分别给予以下处理:(1)LPS组:1mu;g/mlLPS孵育1h;(2)正常对照组:LPS的溶剂PBS孵育1h;(3)阴性对照组:5mu;mol/L15d-PGJ2孵育1h;(4)15d-PGJ2组:5mu;mol/L15d-PGJ2预孵育1h，1mu;g/mlLPS孵育1h;(5)GW9662组:10mu;mol/LGW9662预孵育1h，5mu;mol/L15d-PGJ2孵育1h，1mu;g/mlLPS孵育1h;(6)Vehicle组:即GW9662对照组，使用GW9662的溶剂DMSO替代GW9662。 　　细胞免疫荧光 细胞接种于96孔板中，1times;104/孔，贴壁后用预冷的PBS清洗，4%多聚甲醛室温避光固定15min;用0.5%TritonX-100进行膜通透处理，2%BSA封闭;MIF(1∶50)抗体孵育，4℃过夜;F4/80(1∶200)抗体孵育，37℃1h;加入相应荧光标记二抗，37℃1h，避光;DAPI染细胞核后高内涵自动成像系统进行扫描。阴性对照组不加一抗，其余处理与实验组相同。 　　RT-qPCR 处理后的细胞用预冷PBS清洗，加入350mu;l裂解液，收集裂解底物提取全细胞RNA(QIAGENRNeasyMiniKit)，定量(NanoVue)后取0.5mu;g逆转录(不加逆转录酶作为阴性对照，即NO-RT)，cDNA稀释后进行PCR反应，引物序列。检测的临界点设定在PCR扩增过程中，荧光信号由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环数(Ct)作为模板初始浓度的间接指标，溶解曲线分析采用默认条件。结果以18SrRNA进行校正，用Delta;Delta;Ct法计算相对基因表达量。取PCR产物DNA进行琼脂糖凝胶电泳。胶浓度为2%，电压为100V，电泳时间45min，紫外灯下观察并打印胶片。 　　Westernblot检测 处理后的细胞用预冷的PBS清洗，0.125%胰酶消化后加入蛋白裂解液，提取全细胞蛋白，BCA法蛋白定量(BCATMproteinassaykit)。取50mu;g总蛋白进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(胶浓度15%)，转膜至0.2mu;m的PVDF膜上。5%脱脂奶粉室温封闭1h，孵育MIF抗体(1∶200稀释)，4℃过夜。PBST洗