不同种质和表型当归与习用品东当归、牡丹叶当归的rDNA ITS序列解析.docVIP

不同种质和表型当归与习用品东当归、牡丹叶当归的rDNA ITS序列解析 　　当归为常用中药，始载于《神农本草经》，列为中品。来源为伞形科植物当归Angelica sinensis(Oliv.) Diels的干燥根。有补血活血、调经止痛、润肠通便之功效。目前主要分布在甘肃、云南、四川、湖北、陕西等地。当归的野生资源由于过度采挖已经濒临枯竭。笔者通过当归的种质资源调查，发现当归有紫茎和绿茎之分。另外，四川等地栽种有东当归Angelicaacutiloba (Sieb.et Zucc.) Kitagawa，东当归又称日本当归，在日本作为当归入药。在西藏林芝等地，还有野生的牡丹叶当归(Angelica paeoniifolia Shan et Yuan)，在西藏林芝等地也多将牡丹叶当归的根作为当归入药。 　　随着分子生物学技术的发展，出现了一些新的中药鉴别方法。PCR直接测序法是20世纪90年代迅速发展起来的测序技术，具有快速、灵敏、准确率高等特点。其中核糖体DNA中的内转录间隔区(internal transcribed spacer， ITS)序列的进化速率较快，可用于解决属下不同种和种内的系统发育和分类问题。近几年，该技术在中药材的鉴别中得到一定的应用。本研究通过对14个不同种质和表型的当归及其地方习惯用品东当归、牡丹叶当归的ITS序列进行测序和分析，探讨该片段在中药当归分子生物学水平上的鉴定意义。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　ITS测序序列样品来自14个当归和习用品牡丹叶当归和东当归的新鲜嫩叶。 　　1.2 DNA提取 　　新鲜植物叶片，参照Rodrigues组织培养表面消毒的方法处理后各0.1 g，加液氮研磨成细粉后，使用改良的CTAB 法提取总DNA，于-20 ℃保存备用。 　　1.3 PCR扩增和产物纯化 　　PCR扩增引物为真核ITS扩增专用产物LH2、ITS4。引物均由上海生工生物工程有限公司合成，序列为LH2：5prime;-GTCGAATTCGTA GGTGAACCTGCG-GAAGGATCA-3prime;;ITS4：5prime;-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3prime;。反应液(以20 mu;L/L 反应体积为例)：10times;PCR buffer 2 mu;L，10 mmol·L-1 dNTP 0.5 mu;L，Mg2+(25 mmol·L-1)2.4 mu;L，引物LH2和ITS4(10 mu;mol·L-1)各1 mu;L，Taq 酶(5 U·mu;L-1)0.1 mu;L，DNA模板(适宜浓度)2 mu;L，灭菌三蒸水(3dH2O)10 mu;L。PCR 扩增条件为94 ℃变性4 min，94 ℃ 1 min，50 ℃ 2 min，72 ℃ 1 min，循环30次;72 ℃延伸10 min，以灭菌三蒸水代替模板DNA 作空白对照。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳进行分析。用QIAGENPCR产物纯化试剂盒进行PCR产物的纯化。 　　1.4 PCR产物ITS序列的测定 　　纯化后的PCR产物作为测序反应的模板，PCR反应的引物直接作为测序引物，采用双脱氧终止法终端荧光标记，进行DNA序列的正向和反向测定。测序反应在ABI 377测序仪上进行。所得序列用CLUSTAL X(Version 1.8)进行多重比对，编辑和校正多重比对结果用BioEdit;ITS1和ITS2的位置参照其二级结构和EMBL和Gen-Bank上的参考序列。 　　2 结果 　　根据GenBank中的当归Angelica sinensis (Oliv.) Diels的ITS序列(Genebank：GU289663.1)确定当归和东当归、牡丹叶当归的rDNA内转录间隔区ITS1和ITS2与3个编码区18S、5.8S、26S的界限。测得当归14个个体的ITS-1，5.8S rDNA和ITS-2全序列及18S rRNA基因3prime;端和26S rRNA 基因5prime;端部分碱基序列，共约664bp。其中ITS1序列长度215bp， 5.8S长162bp，ITS2序列长度为223bp。习用品东当归长663bp，其中ITS1序列长度216bp，5.8S长162bp，ITS2序列长度为221bp。习用品牡丹叶当归长664bp，其中ITS1序列长度215bp，5.8S长162bp，ITS2序列长度为223bp。当归ITS1的G+C%含量在54.42%，ITS2的G+C% 含量在55.16%。ITS序列测序结果表明，14个不同种质的当归其ITS序列都全部一致，包括两种表型即紫茎当归和绿茎当归、野生当归和栽培当归。 　　将当归、东当归和牡丹叶当归ITS序列比对