低分子量鱼精蛋白介导的天花粉蛋白的抗肿瘤实践.docVIP

低分子量鱼精蛋白介导的天花粉蛋白的抗肿瘤实践 　　中药天花粉为葫芦科植物栝楼Trichosantheskirilowii Maxim 或双边栝楼T. rosthornii Harms 的根， 具有清热生津、消肿排脓的功效， 主要用于热病烦渴、肺热燥咳。天花粉蛋白(trichosanthin，TCS) 是天花粉的主要有效成分， 具有多种生物活性， 而最引人注目的是其抗肿瘤活性， 研究证明天花粉蛋白对胃癌、子宫颈癌、乳腺癌、肺癌等多种肿瘤细胞有显著的抑制作用。它通过令肿瘤核糖体失活而抑制蛋白合成， 从而杀灭肿瘤细胞。但是由于细胞膜的存在， 只有少数脂溶性、非极性或不带电的小分子可以跨膜自由扩散， 而绝大部分生物大分子药物， 如蛋白质， 难以穿透细胞膜， 无法进入细胞发挥疗效， 这将限制TCS的推广应用。穿膜肽是一类富含精氨酸的多肽，它作为药物载体， 不但能有效携带各类外源性大分子(如多肽、蛋白质、核酸， 甚至为纳米粒子)进入细胞， 且不影响所携带“货物分子(Cargo)”的生物活性。故本课题组通过蛋白重组技术， 构建TCS 的表达系统， 并在其C 端引入半胱氨酸作为修饰位点， 通过化学偶联， 将其与细胞穿膜肽低分子量鱼精蛋白(low molecular weight protamine，LMWP) 通过二硫键结合实现定点修饰。借助LMWP 介导转运提高TCS 进入肿瘤细胞的能力，且肿瘤内还原性环境可使二硫键断裂， 定点释放药物， 从而增强TCS 的抗肿瘤效果， 现报道如下。 　　1 材料与方法 　　1. 1 细胞与菌株菌株E.coli BL21 (DE3) 为本实验室保存， 质粒由上海捷瑞生物工程有限公司构建; 细胞为人乳腺癌MCF-7 细胞、人子宫颈癌HeLa 细胞， 均购于中科院上海细胞库。 　　1. 2 药品与试剂二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)、氯化钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、三羟甲基氨基甲烷、十二烷基硫酸钠(SDS)、乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、巯基乙醇(beta;-ME)、过硫酸铵、甘氨酸、琼脂粉、三乙胺、浓盐酸、氯化钠和咪唑(国药集团化学试剂有限公司); 蛋白胨、酵母提取物(英国Oxoid 公司); 3-( 2 - 吡啶二巯基) 丙酸N - 羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP) 、异丙基-beta-D-硫代半乳糖苷(IPTG)(美国Thermo 公司); BCA (bicinchoninic acid) 蛋白浓度测定试剂盒、青霉素-链霉素双抗(P-S 双抗)、卡那霉素、四甲基乙二胺、胰酶消化液(上海碧云天生物技术研究所); Ellman 试剂(上海沃凯生物技术有限公司); 异硫氰酸荧光素(FITC，探索生物有限科技公司); 四甲基偶氮唑盐(MTT)(美国Sigma-Aldrich 公司); 1640 细胞培养基、澳洲血源胎牛血清(美国Gibco 公司); 实验用水为超纯水， 其他试剂均为分析纯。 　　1. 3 主要仪器Ni2+-NTA 亲和层析树脂(美国Novagen 公司); PWVF 纯水仪、HF90 细胞培养箱(美国Heal Force 公司); IX81 倒置荧光显微镜(日本Olympus 公司); LDZX-50KBS 高温高压灭菌锅(上海申安医疗器械); 微孔滤膜(美国Millipore 公司); Mutifuge X1R 低温高速离心机(美国Thermo公司); Purifier UPC 快速蛋白液相色谱(fast proteinliquid chromatography， FPLC) 、肝素亲和色谱柱(美国通用电气公司); BT25S 电子天平(德国赛多利斯科学仪器公司); LAB850 酸度计(德国肖特股份有限公司); THZ-D 台式恒温振荡器(苏州培英实验设备有限公司); GelDoc XR 凝胶成像系统、Mini-protean 蛋白电泳仪(美国伯乐公司); JY92-IIN 超声波细胞破碎机(宁波新芝生物技术股份有限公司)。 　　1. 4 TCS 重组蛋白的构建、表达通过美国国立生物技术信息中心(NCBI) 基因序列数据库， 构建TCS 的质粒， 并以此为模板， 在其3端插入10个天冬酰胺和1 个半胱氨酸编码序列， 并将此突变体命名为TCS-10N-C。经测序正确后， 将TCS、TCS-10N-C 的质粒转化E.coli BL21 (DE3) 菌株，涂布于含50 mu;g/mL 卡那霉素的固体培养基中过夜培养。次日挑取阳性克隆接种于1 mL 的LB 培养液中(含卡那霉素50 mu;g/mL)， 37deg;C 振摇培养至600 nm 的吸光度值(D 值) 为0.6 ~ 0.8 左右， 按1 ∶ 100 转接至新的LB 培养基， 37deg;C 摇床扩充培养至6