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分析Lentivirus载体对许旺细胞的转染效率 　　0 引言 Introduction 　　近十几年来，神经科学工作者对许旺细胞移植治疗脊髓损伤进行了初步的探索，并证实许旺细胞移植可以促进脊髓损伤近端神经元轴突向远端延伸、损伤神经元髓鞘化，但是功能修复作用却相当有限。于是学者们又利用转基因技术以活化许旺细胞，使其分泌大量脊髓损伤后神经修复的各种神经营养因子，但在转基因载体方面仍主要以反转录病毒、腺病毒及腺相关病毒为主，这些载体对许旺细胞的转染效率普遍不高，而慢病毒由于转染效率高尤其对神经细胞的转染而逐渐成为最近的研究热点。因此，实验以LV三质粒系统构建LV病毒载体，研究其在体外对原代许旺细胞的转染效率。 　　1 材料和方法 Materials and methods 　　设计：对比观察。 　　材料： 　　实验动物：新生两三天SD大鼠20只，解放军第二军医大学实验动物中心提供。实验方法：大鼠许旺细胞培养：取新生两三天SD大鼠的双侧坐骨神经，剥除神经外膜，剪成约1 mmtimes;1 mmtimes;1 mm大小的碎块，用0.3 g/L胶原酶和2.5 g/L胰蛋白酶按1∶2在体积分数5% CO2的37 ℃培养箱中对神经碎块进行消化12 min，离心，去上清，将含体积分数10%胎牛血清的DMED培养基加入沉淀，小心吹打细胞及组织块，混匀后种植，加入适量培养基使培养基刚好漫过植块，置含体积分数5% CO2的37 ℃培养箱培养1 h后追加培养基。次日加入阿糖胞苷(终浓度为10-5 mol/L)，24 h后吸除含有阿糖胞苷的培养液，加入体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液(分别含0.1%的青霉素及链霉素)，并加入2 mol/L forskolin和10 mu;g/L 碱性成纤维细胞生长因子，以后每两三天换液1次。每天观察细胞生长情况，待细胞铺满培养皿底部后传代。LV转染：LV载体由上海吉凯基因化学技术有限公司构建，其滴度为109 TU/L。细胞培养6 d后，用重组LV转染，转染MOI值分别为1，5，10，20，40。转染2 d后给细胞更换培养基，以后每两三天更换1次培养液。转染后第1，3，5，7，9天后在荧光显微镜下观察其荧光表达情况，并在显微镜的计数方格内计算细胞的转染情况。发出绿色荧光的为转染成功的许旺细胞，否则认为没有转染慢病毒的，从而算出转染效率。主要观察指标：①大鼠许旺细胞转染后不同时间绿色荧光蛋白的表达。②病毒转染效率。 　　2 结果 Results 　　2.1 大鼠许旺细胞转染后不同时间绿色荧光蛋白的表达 　　在病毒转染3 d后，各不同MOI值的培养孔中，均能观察到极少量的荧光反应。在第5天时，荧光数量较前明显增多。第7天时达到高峰，第9天的荧光数量与第7天变化不明显。 　　2.2 病毒转染效率 　　从细胞转染效率来看，不同的MOI值明显不同，MOI值为1时的转染效率约为45%，MOI值为5时为80%，MOI值为10时为90%，MOI值为20时为78%，MOI值为40时转染效率为70%。当MOI值为10时其转染效率最高，可达90%。 　　3 讨论 Discussion 　　3.1 许旺细胞基因转染的载体 　　关于许旺细胞基因转染所应用的载体，主要有反转录病毒载体和腺病毒载体。Weidner等应用反转录病毒载体将人神经生长因子基因导入许旺细胞，应用ELISA定量分析发现经基因转染的许旺细胞可分泌神经生长因子36 ng/(106·d)，而未转染人神经生长因子基因的许旺细胞只分泌神经生长因子0.05 ng/(106·d)。Sorensen等用反转录病毒转染许旺细胞，其转染率仅为18%，且目的基因的表达随时间的延长逐渐下降。虽然反转录病毒载体也可转染分裂细胞及非分裂细胞，但是它导入效率低，靶向性差，而且反转录病毒载体的转染率不高，因此它更适合于体外转染。目前，用反转录病毒载体转移基因的研究正在逐步减少。腺病毒载体为双链DNA病毒载体，也可转染分裂细胞及非分裂细胞，表达时间快，表达丰度高，但其基因组由于游离于宿主基因组外，只能瞬时表达外源基因，难于真正满足基因治疗及组织工程技术的应用要求。而近年来研究较多的LV载体，因其强大的转染能力以及较高的转染效率等特点，在基因转染的实验研究中应用越来越广泛。 　　3.2 慢病毒Lentivirus载体的特点 　　慢病毒是反转录病毒的一种，具有反转录病毒的基本结构，但也有不同于反转录病毒的组份和特性，作为基因治疗载体发展起来[13]，最近已用于转基因动物制备。利用LV构建的shRNA载体，与化学合成的siRNA和基于瞬时表达载体构建的shRNA相比，一方面可以扩增替代