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分析pcDNA3．1－HMOX1重组质粒载体的构建与鉴定 　　血红素加氧酶( heme oxygenase，HMOX) 属于微粒体催化酶，是血红素降解的关键酶，可将血红素分解产生一氧化碳、亚铁离子和胆绿素。HMOX 主要存在两种有活性的亚型，即HMOX1 和HMOX2。不同的亚型组织学分布不同，其生物学功能亦有差异。HMOX1属于诱导型酶，分布在所有细胞中; 而HMOX2 属于组成型酶，要表达于脑、睾丸和血管内皮。2013 年2-4 月，本实验拟构建pcDNA3. 1 - HMOX1 重组质粒载体，为后续HMOX1 的功能研究奠定基础。 　　1 材料与方法 　　1. 1 实验材料 　　pcDNA3. 1 质粒载体购自Life 公司;anti - HIS 鼠抗、蛋白Marker、DH5alpha; 菌株购自钟鼎生物; DNA 胶纯化试剂盒、质粒小提取试剂盒购自AXYGEN公司。 　　1. 2 实验方法 　　1. 2. 1 重组质粒的构建使用基因合成的方法合成基因HMOX1，在N 端添加添加了Kozak 序列及His 标签序列，扩增片段大小为897 bp，将扩增后的目的基因双酶切连接至pcDNA3. 1 载体的BamHI 和NotI 之间。次日将全部的连接产物转化DH5alpha; 菌株。 　　1. 2. 2 重组质粒的鉴定挑取阳性克隆至液体培养基作振荡培养，碱裂解法小量提取和纯化质粒，用双酶切电泳后，进一步测序鉴定。 　　2 结果 　　2. 1 插入片段的酶切鉴定pCDNA3. 1 - HMOX1 -HIS 重组质粒转化产物经质粒抽提，BamHⅠ和NotⅠ双酶切后产生约900 bp( HMOX1 目的基因片段长度为897 bp) 和5 500 bp ( pCDNA3. 1 空载体片段长度为5 428 bp) 的2 条条带，实验结果与预期目的片段大小一致。 　　2. 2 阳性克隆测序挑取阳性克隆子测序，紫红色显示为设计的酶切位点，双划线区域为His - Tag 序列，单划线区域为HMOX1 基因区域，插入片段的测序结果与HMOX1 全长序列完全一致。 　　2. 3 阳性克隆比对阳性克隆子测序结果与设计的目的片段预期序列进行比对， 100% 匹配，经比对鉴定，插入的目标片段完全正确。 　　2. 4 pCDNA3. 1 - HMOX1 重组质粒载体图谱成功构建。 　　3 讨论 　　HMOX1 定位于人类22 号染色体( 22q12) ，是一种诱导型反应蛋白。生理情况下，HMOX1 在脾脏以外的组织中呈低表达，在重金属离子、过氧化氢、低氧、内毒素、一氧化氮及其底物血红素的诱导下其表达均可上调。HMOX1 不仅是血红素降解的限速酶，而且参与细胞生长、炎症反应、细胞凋亡等一系列的生物学过程。HMOX1 通过抑制肿瘤坏死因子、白细胞介素- 1 或通过上调白细胞介素- 1 的水平发挥强大的抗炎作用。其代谢产物亚铁离子上调的铁蛋白可保护细胞免受氧化应激损伤; 胆绿素及其进一步代谢产物胆红素，可以通过清除过氧化氢、类脂等，降低机体的炎性反应，最终削弱对细胞的损伤。一氧化碳能够下调内质网应激触发的细胞凋亡，起到保护内皮细胞的作用。HMOX1 参与了从老年痴呆症到癌症等许多疾病的病理生理学过程，其在肿瘤形成过程中的保护性作用机制是近年来研究的热点。现有研究已经表明，HMOX1 在妊娠和子痫前期、消化道系统、呼吸系统、心血管系统等疾病的发生发展中均发挥了重要作用。 　　为了进一步研究HMOX1 在肝癌形成中的作用机制，筛选在肝癌的形成过程中与HMOX1 相互作用的目标蛋白，从功能蛋白质组学的角度分析HMOX1 的作用机制，本研究构建pCDNA3. 1 - HMOX1 质粒载体，并将其转化DH5alpha; 大肠杆菌，实现HMOX1 基因的稳定表达，为后续进一步研究HMOX1 的功能奠定了基础。前期使用基因合成的方法合成HMOX1 基因，提高了目的基因的合成效率。在合成目j的基因的过程中，在其N 端添加了Kozak 序列，增强了HMOX1 基因的转录和翻译效率; 同时添加His 标签序列，为后续研究HMOX1 基因的翻译产物提供了靶标，避免内源性目的基因的干扰。 　　转化DH5alpha; 大肠杆菌后，抽提质粒载体，经BamHⅠ和NotⅠ双酶切电泳，在5 500 bp 和900 bp 处可见两条条带，分别代表pCDNA3. 1 质粒片段和HMOX1片段，说明成功构建了重组质粒载体，并在DH5alpha; 大肠杆菌中成功表达。为了保证目的基因的正确性，避免在电泳中出现的假阳性干扰，我们同时对从DH5alpha; 大肠杆菌阳性克隆中抽