分析丹参总酚酸对大鼠缺血性脑卒中后的改善作用.docVIP

分析丹参总酚酸对大鼠缺血性脑卒中后的改善作用 　　脑卒中是最常见的脑血管病之一，具有发病率高，死亡率高和致残率高的特征，已成为我国人口致残的首位原因。其中缺血性脑卒中为主要的发病类型占脑卒中发病率的70%～80%。目前针对缺血性脑卒中尚缺乏有效的治疗措施，唯一有效的“溶栓治疗”治疗窗窄，且易引发出血等，并未显著改善脑卒中患者的死亡率和致残率。现已证实，卒中相关的感染(strokeassociatedinfection，SAI)是导致患者死亡或致残的首要原因。Westendorp等发现，SAI患者30d内的死亡率为27%，而非SAI患者的死亡率仅为4%;SAI患者出院时能独立行走的约为9%，而非SAI患者为43%。因此，积极有效地预防或控制SAI对于改善患者的生存率和生活质量具有重要的意义。目前临床治疗多以预防性抗生素、肾上腺素拮抗剂(普萘洛尔)和免疫调节剂作为SAI的主要治疗药物，但存在细菌耐药和二重感染等风险。因此，积极有效调控卒中后免疫抑制现象对于SAI的预防及治疗具有重要的治疗价值。丹参总酚酸注射液作为治疗脑卒中药物已广泛应用于临床实践中，可显著改善卒中患者病情，提高患者生存质量。但其对SAI是否具有预防或治疗作用尚未明确。本研究采用大脑中动脉栓塞(middlecerebralarteryocclusion，MCAO)法制备大鼠脑缺血再灌注模型，观察丹参总酚酸对脑卒中后免疫抑制的影响，探讨其对卒中后继发炎症的预防或治疗作用。 　　1材料与方法 　　1.1实验动物、药物、试剂和仪器 　　清洁级SD大鼠180只，雄性，体质量280～300g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号:SCXK(京)2002-0003。动物饲养于12h:12h昼夜周期空调房内(7:00-19:00)，温度为23～25℃，湿度为50%～60%，自由进食饮水，动物适应环境1周后开始进行实验。本研究所有实验动物操作均参照山西中医学院动物伦理法规进行。丹参总酚酸由中国医学科学院药物研究所提供，其中丹酚酸B含量为56.65%，丹酚酸溶于无菌生理盐水中，浓度分别为0.5，1.0和2.0g·L-1，用于静脉注射。Trizol，美国Invitrogen公司;水合氯醛，国药集团;实时定量PCR试剂盒，北京全式金生物科技有限公司;肿瘤坏死因子alpha;(tumornecrosisfactor-alpha;，Tnf-alpha;)，白细胞介素1beta;(interleukin-1beta;，Il-1beta;)，Il-4，Il-10，干扰素gamma;(interferon-gamma;，Ifn-gamma;)，Il-2和3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde3-phosphatedehydrogenase，Gapdh)引物，由北京擎科新业生物科技有限公司合成Ficoll-Paqueplus淋巴分离试剂盒，美国GEHealth公司;Percoll细胞分离液，北京索莱宝科技有限公司;RPMI1640培养基，美国Invitrogen公司);ACK红细胞裂解液，碧云天生物技术研究所;抗CD45RA抗体、FITC标记T细胞受体(FITC-Tcellreceptor，FITC-TCR)抗体、R-藻红蛋白标记自然杀伤细胞受体(R-phycoerythrin-naturalkillerreceptor，RPE-NKRP)抗体、生物素标记抗信号调节蛋白(biotin-signalregulatoryprotein，biotin-SIRP)抗体、生物素标记抗CD4(biotin-CD4)抗体、藻红蛋白标记抗CD8a(PE-CD8a)抗体、多甲藻黄素叶绿素蛋白标记CD25(PerCP-CD25)抗体和FITC标记FOX蛋白3(FITC-Foxp3)抗体，均购自英国AbD公司。ABI7500型RealtimePCR仪，美国ABI公司;BDFACSCALIBUR流式细胞仪，美国BD公司;低温离心机，德国Sigma公司;细胞过滤网，美国Bioluogix公司。 　　1.2大鼠脑缺血再灌注模型制备 　　采用MCAO法制备脑缺血再灌注模型。参照Longa等的方法并加以改进。大鼠经水合氯醛(350mg·kg-1，腹腔注射)麻醉后，仰卧固定在手术台上。颈部消毒，颈前正中做2cm切口，钝性分离皮下软组织、肌肉，暴露分离颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉。用0号手术线结扎颈外动脉及其分支，在颈总动脉分叉前及颈内动脉近颅端置动脉夹，在颈外动脉距离颈总动脉分叉3～4mm处做微切口。松开颈内动脉的动脉夹，插入特制尼龙线(长50mm，直径0.26mm)，沿颈内动脉推进至大脑中动脉起始部，约18.0～19.0mm，遇阻力而停止，造成大脑中动脉起始端