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四种板兰根提取物抗流感病毒作用实验讨论 　　板蓝根(Radix Isatidis)为十字花科菘蓝属植物菘蓝(Isatis indigotica)的干燥根，性寒味苦，具有清热解毒、凉血利咽的功效，临床上广泛用于治疗流感、病毒性肝炎、扁桃体炎等细菌、病毒感染性疾病。现代药理学研究表明，板蓝根具有抗菌、抗病毒、抗内毒素、抗癌、抗血小板聚集、提高免疫力等多种药理作用。有关板蓝根抗病毒及作用成分的研究已有许多报道。本研究探讨了板兰根的抗流感病毒作用与其提取物的关系。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 药物：板蓝根注射液，山西晋新双鹤药业有限责任公司，批号200709019，1g 生药/2ml/支;板蓝根颗粒，北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂(6110573)，1.2 g 生药/g;板兰根中性、酸性、碱性和两性提取物。 　　1.1.2 病毒株：流感病毒：流感甲型72-243(H3N2亚型)，本院微生物教研室保存。 　　1.1.3 鸡胚：9~11d 龄鸡胚，购自天津羽丰种鸡厂。 　　1.1.4 ICR 小鼠：15～20g，雌雄各半，购自北京维通利华实验动物技术有限公司(许可证号：SCXK 京2002-001)。1.1.5 试剂：刀斗蛋白A(conA，sigma 公司，批号：C-2010);脂多糖(LPS，sigma 公司，批号：1-2880);MTT(Amresco 公司，批号：0895);RPMI-1640 培养基(GIBCO 公司，批号：1181499);类标准胎牛血清(FCS，美国Hyclone 合资兰州民海生物工程公司，批号：ATM111171)，其它常规试剂。 　　1.2 方法 　　1.2.1 病毒传代及LD50、EID50测定： 　　1.2.1.1 病毒传代：毒株接种9 d 龄鸡胚尿囊腔，72 h无菌收获尿囊液，血凝试验确定尿囊液血凝效价，-80℃保存备用。 　　1.2.1.2 小鼠LD50测定：ICR 小鼠随机分6 组，每组4只。将收获的病毒(效价1：640)用生理盐水10 倍递次稀释成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6 6 个浓度;乙醚轻度麻醉后，分别滴鼻接种6 组小鼠，每只小鼠滴鼻接种50mu;l。观察14 d，记录动物死亡情况，按Reed Muench 法计算LD50，得LD50为10-3。 　　1.2.1.3 鸡胚EID 测定： 病毒株稀释成10-1、10-2、10-3……10-9不同稀释度，分别接种9 d 龄鸡胚尿囊腔，每胚0.2 ml，每组4 只鸡胚，常规培养3 d，无菌取尿囊液作血凝试验，记录结果，按Reed Muench 法计算半数感染量(EID50)。 　　1.2.2 板蓝根4 种提取物在鸡胚内抗流感病毒作用： 　　1.2.2.1 对鸡胚的毒性测定：将4 种提取物按5 g 原生药/ml 的原始浓度连续做2 倍稀释至4~5 个浓度，然后接种鸡胚，每只0.2 ml，每组5 只，并设生理盐水对照和四种成分原液阳性组，置37℃培养。常规培养4d，每天记录鸡胚的生长发育、存活情况，以鸡胚全部健康存活96 h 的最大药物浓度为药物的最大无毒剂量。结果显示鸡胚能耐受的药物最大浓度大于5 g 原生药/ml 为无毒类物质。 　　1.2.2.2 分组及给药方法：以无菌的4 种提取物含0.5 g 原生药/ml 为高剂量组(根据注射剂和颗粒剂含量设定)，再分别等比稀释成0.25 g 原生药/ml 和0.125 g 原生药/ml 2 个浓度，分别设为中、低剂量组，同时设板蓝根注射剂组(0.5 g 原生药/ml)和板蓝根颗粒组(0.5 g 原生药/ml)，分别与病毒液(10times;EID50)混合，37ujRcp℃作用1h 后接种9 d 龄鸡胚尿囊腔，每只0.2 ml，每组5 只，另设空白对照组(不含病毒和药物)，病毒对照组(仅接种等体积10times;EID50病毒液)，72 h 后收获尿囊液，血凝试验测定病毒效价。 　　1.2.2.3 统计学分析：各组数据以(