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Lezione 11-12 RT-PCR 17-11-2006 PCR e RT-PCR RT-PCR da RNA La reverse trascrittasi RT Cosa deve fare la RT RT-PCR dal II filamento in poi Risultati della ricerca sul sito NCBI R.A.C.E. Differenze nella ricerca di 5’ o 3’ ignoti Cerchiamo il 3’ sconosciuto * Analisi della trascrizione tramite PCR Analisi della trascrizione e non determinazione del PM dei trascritti (Northern) Analisi dei livelli di trascrizione più fine per la sensibilità del metodo, se si vedessero tramite Northern le stesse quantità il Northern sarebbe più informativo (anche PM) Ampliconi possibilmente a cavallo di introni, perché ? Nella RT-PCR valgono tutte le stesse regole della PCR, in più ci sono delle differenze dovute alla trasformazione (retrotrascrizione) del mRNA in cDNA. Variabili della PCR : primers (temp. Melting omogenea) specificità di appaiamento assenza di “hairpins” terminaz. non coesive condizioni di reazione e reagenti conc. polimerasi, Mg, tampone, dNTPs, DNA, primers, temp. e durata dei cicli Nella RT-PCR si deve retrotrascrivere mRNA in cDNA Per RT si intende reverse transcriptase su templato di RNA Per avere un cDNA (DNA complementare ad un RNA messaggero) si deve retrotrascrivere l’mRNA cioe’ farlo diventare DNA I retrovirus ad RNA fanno la sintesi del DNA complementare al loro cromosoma ad RNA tramite una DNA polimerasi specifica che usa come templato RNA anziche’ DNA. Pero’ sempre con la sintesi in direzione 5’-3’come ogni polimerasi. L’enzima “reverse transcriptase” o trascrittasi inversa che si utilizza non e’ termoresistente, ma deriva da un retrovirus eucariotico, AMV avian myeloblastosis virus, M-MuLV Moloney leukemia virus murino ed anche altri. Piu’ recentemente sono state isolate e clonate delle RT mutanti che resistono a temperatura piu’ alta di 37°C fino a 60°C. Le tecniche precedenti per lo studio della trascrizione erano l’analisi Northern e l’isolamento dei cDNA da libraries clonate in vettori vari. L’uso della reverse trascritt