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MIDI微生物鉴定（脂肪酸分析）系统PLFA 应用案例及其它 颜淑玮 2011.1.4 PLFA分析原理 PLFA定义 PLFA 是磷脂脂肪酸(phospholipid fatty acid) 的英文缩写。PLFA 是构成活体细胞膜的重要组分 群落分析基本原理 部分PLFA 总是出现在同一类群的微生物中, 而在其它类群的微生物中很少出现 PLFA混合样本分析 根据不同类群微生物的指示性PLFA不同, 通过提取和分析指示性PLFA , 测定其含量, 可定量反映活体微生物中不同类群的生物量及总生物量。 应用范围 指示环境因素变化对微生物群落变化的影响（包含菌根共生，植物与微生物相互作用） 领域细分 环境与资源科学 农林牧渔科学 植物与土壤科学 海洋、水文/水利、河流/湖泊科学 生态与环境保护科学 其他群落分析方法 DNA测序（STS-PCR（sequence-tagged site）+T-RFLP/DGGE/TGGE；二代测序仪，100万条序列/次） Boilog法（碳源代谢差异） PLFA分析优势： 灵敏度、准确性（SD小）；取样便利，保真性；工作量；成本（二代测序10万RMB/次） MIDI在PLFA中的优势 MIDI 提取及分析方法由于低成本、其简单性、可同时处理大量样品而被广泛应用于土壤微生物群落研究 GC-MS进行PLFA分析 微生物指示性PLFA的特异性文库 工作量 MIDI PLFA方法研发中！（预计3月底完成第一步） PLFA特征性脂肪酸文库(C9-C30) 标准化提取方法（2天 2小时） GC分析时间：15min PLFA专用标准品 ≈$2000 PLFA研究案例分析 文献标题： The effects of mineral fertilizer and organic manure on soil microbial community and diversity 研究单位： 南京师范大学 化学与环境学院及生命科学学院 杂志名称：Plant Soil 接收日期：2009-3-25 分析方法及结果 分析结论 1 细菌及放线菌PLFA含量在OM+NPK样本中最高，N样本中最低 OM+NPK施肥方式显著刺激土壤原核生物生长，单纯N肥施肥方式则有抑制作用（导致酸化降低微生物群落丰度及多样性） 2 土壤中细菌特别是革兰氏阴性菌含量最高，对土壤施肥方式更敏感，相对于真菌及放线菌指示性更强。 3 革兰氏阳性及厌氧菌PLFA含量在OM样本中最高，而真菌PLFA在NPK样本中最高 革兰氏阳性菌对有机肥敏感而真菌对无机肥敏感 4 真菌PLFA含量在NPK样本中最高，P样本中最低 NPK均衡施肥对土壤真菌生长重要 4与1不一致 细菌、真菌对有机肥和无机肥应答不同 PCA（Principal Component Analysis ）原理 多样本多维分析（以脂肪酸为维） 二维界面显示 （ex. PC1 vs. PC2） 最大程度展示系统变异（PC1PC2……) 当累计方差贡献率大于80%，可全面反映系统变异 样本固有性质在反映变异情况的二维主成分界面上得以展现，由其本身性质决定丛集或分离。 PCA案例一 PCA案例二 微生物鉴定应用注意点 优势 一步鉴定到株型(菌库中已有菌株），亲缘性分析可分型 弱势 肠道菌（遗传高度相关）鉴定准确性为属级，推荐使用碳源利用鉴定法 关于配置 2011年MIDI发布必威体育精装版GC配置，已转发大家，请注意更新 安捷伦提供电脑默认为WIN7系统，与MIDI不兼容。建议自购电脑或提前告知安捷伦销售更改发货电脑系统。 谢 谢！ 有问题吗？欢迎讨论 小测试： MIDI相对GC-MS在PLFA分析中有哪些优势？ Biolog在群落分析中的局限主要是什么？ MIDI在微生物鉴定中的优势及弱势 MIDI软件安装的操作系统局限 PLFA应用领域有哪些？ * * 脂肪酸分组：细菌（革兰氏阳性/阴性、嗜氧/好氧）、真菌、放线菌 含量小于1%及单一样本中检出的PLFA被剔除分析，检出29种显著PLFAs。 用PLFA总量（19:0 FAME内标法定量）表征微生物总量，主要含量组成为cy17:0, 16:0, 2- and 3-OH-FAs, 18:1ω9, 18:2ω6,9 及 a17:0，占总量约40%。 主成分的组成因素：第一主成分主要综合微生物PLFA总量和细菌PLFA 第二主成分主