共聚焦显微镜-北京大学单分子与纳米生物学实验室.ppt

尼罗红(Nile red):是一个理想的脂肪染色剂,它只在疏水环境中显示很强的荧光.除了在所需显示的脂质中被溶解外,尼罗红与组织不发生任何反应. 利用相应的特异荧光控针标记后 观察单个细胞不同部位或不同组织区域接受刺激后的整个变化过程 (一)实时定量测定细胞内Ca2+的变化 (二)测定细胞内PH变化 (三) 检测膜电位的变化 (四)检测细胞内活性氧物种的产生 (五)检测药物等跨膜进入组织或细胞过程及其定位 (六)检测荧光共振能量转移(FRET) (七)检测荧光漂白恢复(FRAP) 基本原理: a其乙酰羟甲基酯(AM)形式是Fluo-3AM,无荧光,为不带电荷的亲脂性化合物,易于渗透脂膜进入活细胞内 b在胞内被非特异酯酶水解,释放出游离酸形式的荧光探针分子,此游离态也无荧光,不易漏出胞外 c一旦与Ca2+结合后便形成复合物,并有较强的荧光产生,从而发挥其钙探针的作用. KCL诱导的细胞外Ca++内流测量 培养/分离的细胞 ? 20?M Fluo 3-AM负载液30-60min ? 清洗、换液 ? 扫描 KCL 若须快速测量 1.改变扫描速度 2.采用双向扫描 3.减少采样点数(牺牲空间分辨率） 4.采用线扫描(xt) KCL 常用的荧光探针有BCECF和6-COFDA BCECF的激发光谱是PH依赖性的 比例法:即分别用490nm和440nm光激发BCECF所得到的发射荧光之比(比例荧光与PH有很好的线性关系) 最大分辩率为0.4PH单位. 快响应探针: 膜电位直接影响探针分子的电分布而改变其光谱,响应快 慢响应探针: 主要通过改变其在膜内外的分布来对膜电位的变化作出反应.跨膜运动需要一定的时间,所以反应慢. 依探针对电位变化响应速度,将电位敏感探针分为快响应探针和慢响应探针 基本原理: a DCFH-DA进入细胞后 b 经酯酶作用脱去二酯,生成不发荧光的DCFH c 被超氧阴离子,过氧化氢等活性氧化生成发荧光的DCF d 活性氧自由基的含量与荧光探针之荧光强度成正相关 DCFH-DA常用于直接测定细胞内活性氧自由基的动态变化 为检测药物分子,病毒,细菌等外界物质能否跨膜进入细胞/组织,需利用这些物质特异性自发荧光/对其进行荧光标记. 由于荧光蛋白的独特优点,其特定的荧光对理论上可用于活细胞中实时研究大分子间的相互作用. 荧光能量共振转移 (Fluorescence Resonance Energy Transfer) I.荧光能量共振转移: 受激态荧光素将其能量向另一个荧光素传递，使后者被激发，这一过程称荧光能量共振转移。能量的提供者叫供体荧光素，能量的接受者叫受体荧光素。 供体荧光素 受体荧光素 1.供体与受体间的距离 10nm或=1-7nm 2.供体的发射光谱与受体的吸收光谱有实质性的重叠 II.荧光能量共振转移的条件 488nm 520nm 650nm 540nm 650nm 488nm 520nm 供体荧光素 (Cy2) 受体荧光素 (Cy3) 供体荧光素 (Cy2) 受体荧光素 (Cy3) FRAP:是将待测细胞用荧光物质标记,借助高强度脉冲式激光照射细胞的某一区域,从而造成该区域荧光分子的光淬灭;通过低强度激光扫描成像,可以探测到该区域周围的非淬灭荧光分子向受照射区域扩散的速率. 从理论上讲,凡是能够标记待测分子,并且能够发生荧光淬灭的荧光物质都可以使用. Intensity Before bleach After bleach 90 min after bleach 1. 荧光漂白恢复 (Fluorescence Recover after photobleaching; FRAP) 检测细胞连接间的信息传递 多光子激光扫描显微镜— Multiphoton Laser Scanning Microscopy 在生物及医学成像,单分子探测,三维信息存储,微加工等领域得到广泛应用,展示了广阔的发展前景. 多光子激光器波长从700-1000nm连续可调 双光子波长：350-500nm 连续 三光子波长：230-330nm 连续 应用：可直接清晰活体观察某些非标记神经递质的分泌 (5-HT) 或 NADPH的分布 双光子激光扫描荧光显微系统 照射光波长大于荧光染料吸收峰波长2倍 高能量(2KW)、超短脉冲(兆分之一秒)聚焦, 使