桑叶提取物对小鼠感染甲型流感病毒FM1 的预防与治疗作用讨论.docVIP

桑叶提取物对小鼠感染甲型流感病毒FM1 的预防与治疗作用讨论 　　桑是传统的药食两用植物，入药可追溯至《神农本草经》。桑叶是桑科植物桑( Morus alba L. ) 的干燥叶，性寒、味甘苦，具有疏风散热、清肺润燥、清肝明目的功效。桑叶含有丰富的化学成分，具有多种药理学活性，作为单方或复方在临床上广泛应用。桑叶作为广东凉茶和夏桑菊的主要成分之一，是华南地区用于清热解毒、预防或治疗感冒及上呼吸道感染的常见药。研究表明，桑不同部位的提取物对多种病毒具有体内或体外的抗性活性，桑叶的抗流感病毒活性研究也有部分报道，但多数停留在细胞水平的初步检测，其预防及治疗流感的体内检测及机制研究较少。根据已报道的提取分离方法，桑叶初提时一般分成石油醚组分、乙酸乙酯组分、正丁醇组分及水相组分4 个部位，其中乙酸乙酯提取部位的主要成分包括Diels-Alder 型加合物、二苯乙烯、苯并呋喃及黄酮等多酚性化合物，表现出降血压、抗病毒、抗菌、抗氧化、抗炎以及抗肿瘤等多方面生物学活性。前期研究中对广东桑不同品种桑叶的4 个提取部位进行了细胞水平抗病毒活性的筛选，发现抗青10 号桑叶的乙酸乙酯部位具有较好的体外抗流感病毒活性，故选择此部位进行体内实验，以期对桑叶在预防和治疗流感病毒感染中的应用提供理论依据，为其抗病毒机制做更深入的研究奠定基础。 　　1 材料 　　1. 1 实验动物清洁级昆明小鼠，体质量18 ～ 22g，雌雄各半，由广东省实验动物中心提供，许可证号: SCXK( 粤) 2008-0002。 　　1. 2 病毒株甲型流感病毒鼠肺适应株FM1，由暨南大学医学院微生物学实验室保存，在9 日龄鸡胚中增殖复壮，收集尿囊液，测定其血凝效价为1∶320，于- 80 ℃冻存备用。 　　1. 3 药物与主要试剂桑叶提取物: 广东桑抗青10 号的干燥桑叶用70%乙醇浸提3 次，粗浸膏再用乙酸乙酯萃取3 ～ 5 次，萃取组分旋转蒸发回收溶剂，得乙酸乙酯组分5 g，用二甲基亚砜( DMSO) 配制成质量浓度为200 mg /mL 的母液于- 20 ℃保存，用时以生理盐水稀释至所需浓度。利巴韦林( 批号: 国药准字 为华中药业股份有限公司产品。 　　1. 4 RT-PCR 试剂盒及引物设计TRIzol Reagent购自北京康为世纪生物科技有限公司; All-in-oneTMFirst-Strand cDNA Synthesis Kit 由广州复能基因有限公司提供; All-in-oneTM qPCR Mix 由广州复能基因有限公司提供。PCR 引物序列由英潍捷基上海贸易有限公司合成，内参照基因GAPDH 正向序列: 5#39;-CTTTGGCATTGTGGAAGGGCTC-3#39;，反向序列: 5#39;-GCAGGGATGATGTTCTGGGCAG-3#39;; 目的基因HA正向序列: 5#39;-GACCAATCCTGTCACCTCTGAC-3#39;，反向序列: 5#39;-GGGCATTTGGACAAACGTCTACG-3#39;。 　　2 方法 　　2. 1 桑叶提取物急性毒性试验24 只健康昆明小鼠随机分为4 组，正常对照组灌胃生理盐水，3个实验组分别按2 500、500、100 mg /kg 灌胃桑叶提取物，灌胃体积均为0. 5 mL /只。给药1 次，当天密切观察小鼠的症状和体征，随后连续观察7 d。实验结束前小鼠禁食水8 h 以上，称量质量后颈椎脱臼处死，解剖并观察肝脏、脾、胃、肠的组织形态。 　　2. 2 桑叶提取物对流感病毒的治疗作用48 只健康昆明小鼠随机分为6 组，即正常对照组( 不感染病毒，灌胃生理盐水) 、模型组( 感染FM1 后灌胃生理盐水) 、阳性药物对照组( 感染FM1 后灌胃利巴韦林， 70 mg /kg) 及桑叶提取物的高、中、低剂量组( 感染FM1 后分别按1 000、500、100 mg /kg 灌胃桑叶提取物) 。小鼠采用滴鼻法感染流感病毒FM1，滴鼻前用乙醚轻度麻醉。模型组、阳性药物对照组及各给药组以血凝效价为1∶ 320 的FM1 病毒液40 mu;L /d连续滴鼻3 d，正常对照组用等量生理盐水做相同处理。各组小鼠均在第4 天开始灌胃给药，剂量为0. 5 mL /d，连续灌胃5 d。滴鼻及灌胃期间所给食物定量( 3 g /只) ，每天观察小鼠的症状和体征。给药完成后所有小鼠禁食水至少8 h，处死取肺做相应检测。 　　2. 3 桑叶提取物对流感病毒的预防作用动物分组及给药方法同“2. 2”项，但改变病毒滴鼻和灌胃给药的时间顺序。即各组小鼠先分别灌胃生理盐水、阳性药物或不同浓度的桑叶提取物，连续5 d。从第6 天开始，各组小鼠分别滴鼻给生理盐水或病毒液