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检测人神经生长因子重组慢病毒载体的构建 　　神经生长因子(nerve growth factor，NGF)是目前发现最早、研究最为透彻、应用最广泛的神经营养因子。NGF对神经元的存活、生长发育、分化、再生和功能维持起着调控作用。最近研究发现，在糖尿病神经源性膀胱(diabetic neurogenic bladder，DNB)动物模型中，交感神经支配的靶器官NGF含量明显减少，这提示NGF减少可能跟DNB 的发生发展存在一定的关系。笔者的前期研究亦发现NGF 在糖尿病大鼠膀胱和骶髓背根神经节中低表达，在糖尿病膀胱病变中发挥重要作用。本实验成功构建NGF重组慢病毒，其表达也在293T 细胞中得到验证，为进一步研究NGF与DNB 发生发展之间的关系以及采用外源NGF治疗DNB奠定基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 细胞及质粒293T 细胞(实验室现有)，大肠杆菌菌株DH5alpha;、GV287 慢病毒载体、pHelper1.0、pHelper2.0(购自上海吉凯基因公司)。 　　1.1.2 试剂与器械1 kb DNA ladder Marker(购于立陶宛Fermentas 公司);250 bp DNA ladder Marker(购于上海捷瑞公司);In-FusionTM PCR Cloning Kit(购于美国Clontech 公司);聚合酶(购于上海欣百诺公司);限制性内切酶(购于美国NEB 公司);质粒抽提盒(购于美国Promega 公司);琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(购于北京天根生化公司);胎牛血清、DMEM(购于美国Gibco 公司);Opti-MEM、Lipofectamine2000(购于美国Invitrogen 公司);蛋白检测试剂盒(购于美国HyClone-Pierce 公司);Prestainedprotein marker(购于上海中晶公司);ECL-PLUS/Kit(购于英国Amersham 公司);PCR 仪(购于美国Applied Biosystems 公司);生物安全柜(购于新加坡ESCO 公司);空载体病毒(购于上海吉凯生物科技公司)。 　　1.2 方法 　　1.2.1 NGF重组慢病毒质粒的构建和检验慢病毒载体GV287 原件顺序为：Ubi-MCS-3FLAG-SV40-EGFP，克隆位点为AgeⅠ。设计合成PCR 引物：上游引物5 #39; -GAGGATCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGTCCATGTTGTTCTACAC-3#39; 和下游引物5 #39; - T C C T T G T A G T C C A TACCGGCTCTTCTCACAGCCTTC-3#39;，利用PCR 方法钓取NGF 基因。将GV287慢病毒质粒进行酶切，酶切产物电泳后回收。PCR 产物NGF 基因交换入线性化GV287 慢病毒质粒，定向克隆连接成为NGF重组慢病毒质粒。用氯化钙制备新鲜的大肠杆菌DH5alpha; 感受态细胞。NGF重组慢病毒质粒转化感受态细胞。对转化后长出的阳性克隆进行PCR 及测序鉴定。 　　1.2.2 NGF 重组满病毒的包装将处于对数生长期的293T 细胞悬液接种于24孔板中，接种密度为6times;105细胞/mL，37 ℃、5%培养箱培养至细胞融合80%，制备编码慢病毒颗粒的重组病毒质粒GV287 及两种辅助包装原件载体质粒pHelper1.0、pHelper2.0，三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素提取，按Lipofectamine2000 使用说明进行共转染293T细胞，转染后8 h 更换为完全培养基。 　　1.2.3 NGF 重组慢病毒的功能检测待共转染293T 细胞24 h 后，在荧光显微镜下观察荧光标记基因的表达情况，判断感染效率，荧光拍照后补加500 mu;L完全培养基，转染36 h 后，收集细胞进行Western Bolt，检测NGF的表达情况。 　　1.2.4 NGF 重组慢病毒质粒的收获、浓缩、滴度测定培养48 h 后，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，对其浓缩得到高滴度的慢病毒浓缩液。将病毒浓缩液移出，分装后保存在病毒管中，于-80 ℃长期保存。取出一支用实时定量PCR 法测定并标定病毒滴度。 　　1.2.5 介导NGF 慢病毒转染脐带间充质干细胞将处于对数生长期的脐带间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)悬液接种于的24 孔板中，接种密度为4times;105细胞/mL，37 ℃、5%培养箱培养至细胞融合50%，分别以感染复数(multiplicityof infection，MOI)5、50、10