欧洲型PRRSV重组腺病毒疫苗的构建效果评价.docVIP

欧洲型PRRSV重组腺病毒疫苗的构建效果评价 　　猪繁殖与呼吸综合征(porcine　reproductive　andrespiratory　syndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine　reproductive　and　respiratory　syndrome　Virus，PRRSV)引起的猪繁殖与呼吸系统疾病。目前该病在全球范围广泛流行，严重影响养猪业的健康发展。目前根据PRRSV 基因型和抗原性差异可分为2个基因型，分别是欧洲型(基因Ⅰ型，代表株为LV 株)和美洲型(基因Ⅱ型，代表株为VR-2332)。一直以来，我国主要流行株为美洲型及其变异株，但如今欧洲型PRRSV 的流行已经打破了地域的限制，近年来相继在福建，香港、内蒙古等地分离到欧洲型PRRSV。而该病曾在欧洲大规模流行，对养猪业造成严重损失，因此对欧洲型PRRSV 的预防显得愈加重要。目前防控欧洲型PRRSV感染的商品化疫苗仅有灭活疫苗，但其免疫效果不十分理想，只能提供部分保护，不能预防感染。因此凾待研发一种新型有效的疫苗。 　　腺病毒载体在基因治疗和疫苗生产中显示了较好的应用前景，其具有宿主范围广，病毒滴度高，可插入较大的外源基因片段且不整合到宿主基因组等特点，是一种应用广泛的基因治疗载体。本研究以欧洲PRRSV　LV株ORF3、ORF5基因为对象，以人腺病毒五型为载体，构建重组腺病毒，并通过小鼠试验评价其免疫原性。 　　材料与方法 　　1　材料 　　1.1　基因、质粒及细胞株 　　PRRSV　LV 株ORF3、ORF5基因由上海捷瑞生物工程有限公司合成;人腺病毒五型野毒(Adenovirus　5 wild-type，Ad5-wt)、pacd5K-N　pA 、pacad5　9.2-100质粒和HEK　293细胞由本室保存。 　　1.2　试验动物 　　BALB/c小鼠，雌性，6～8周龄，体重20～30g，共50只，购于吉林长春生物制品所。 　　1.3　主要试剂 　　Ex　Taq　DNA 聚合酶，DL2000Marker及各种限制性内切酶均购自于宝生物工程(大连)有限公司;大肠埃希菌DH5alpha;感受态细胞购于北京全式金生物技术有限公司;硝酸纤维素膜购于美国Merck　Millipore公司;小鼠抗LV 血清由本室保存;HRP标记山羊抗鼠二抗购于博士德生物工程有限公司;X-OMAT　BT医用X射线胶片购于加拿大Carestream公司;转染试剂X-treme　GENE　HP购自瑞士Roche公司;DMEM 及胎牛血清购自美国HyClone公司;胶回收试剂盒和基因组DNA 提取试剂盒购自美国Axygen　Biosciences公司;其它试剂均为国产分析纯。 　　2　方法 　　2.1　引物设计 　　根据PRRSV　LV 株ORF3、ORF5基因组序列，应用Prime　5.0设计6条引物，其中引物ORF3-R(W)中无终止密码子，引物ORF5-F(Linker)中含有自裂解linker序列。 　　2.2　目的基因ORF3、ORF5的扩增 　　以PUC-EUORF3、PUC-EU-ORF5质粒为模板，分别应用引物ORF3F/ORF3R和ORF5F/ORF5RPCR扩增ORF3和ORF5目的基因。应用ORF3/ORF5(W)引物扩增不含终止密码子的ORF3基因，应用ORF5-F(Linker)/ORF5R 引物扩增含有自裂解linker序列的ORF5基因，再以二者PCR 产物为模板，以ORF3/ORF5为引物进行重叠PCR。反应条件：94℃预变性5min;94℃变性30s，60 ℃退火30s，72 ℃延伸1min，72℃再延伸10min。将扩增片段连接至PMD-18TVector(于孵育器中16℃连接过夜)，构建克隆质粒18T-EU-ORF3、18T--EU-ORF5 和18T-EUORF3-ORF5并转化至DH5alpha;，而后小提质粒并测序。 　　2.3　穿梭质粒的构建 　　将构建的18T-EU-ORF3、18T-EU-ORF5和18T-EU-ORF3-ORF5分别与穿梭质粒pacad5K-N　pa以BamHⅠ/XbaⅠ、XbaⅠ/NotⅠ、BamHⅠ/NotⅠ进行双酶切，然后在T4DNA 连接酶作用下连接、转化，小提质粒后酶切验证。 　　2.4　质粒的共转染 　　将构建的腺病毒穿梭质粒与骨架质粒用PacⅠ酶切线性化后，以2mu;g质粒与2mu;l　Xtreme　GENE　DNA 转染试剂、200mu;l　OPTI-MEM 混匀后共转染至80%的HEK　293单层细胞中，1h后补加1