比较马钱子组分对人HaCaT细胞毒性的作用.docVIP

比较马钱子组分对人HaCaT细胞毒性的作用 　　陈马钱子StrychniSemen为马钱子科植物马钱子Strychnosnux-vomicaL.及云南长籽马钱StrychnospierrianaA.W.Hill的干燥成熟种子，它的主要有效成分为马钱子生物碱，约占2%～5%，现已分离得到16个生物碱，其中最重要的为番木鳖碱(士的宁，strychnine)和马钱子碱(布鲁生，brucine)，约占总生物碱的70%。马钱子生物碱具有抗炎、镇痛的功效，临床与实验治疗类风湿性关节炎(rheumatoidarthritis，RA)效果显著。目前，马钱子治疗类风湿性关节炎的临床应用和实验性研究方面，主要有口服制剂和经皮给药制剂两类。其中，经皮给药制剂可以降低直接口服毒性药物马钱子的中毒风险。虽然有文献报道了动物实验研究马钱子制剂的皮肤刺激性，但是从细胞水平研究马钱子生物碱不同组分对皮肤的毒性作用，笔者尚未见国内文献报道。本研究利用体外培养HaCaT细胞，观察马钱子总生物碱(totalstrychnosalkaloids，TSD)及其不同组分对HaCaT细胞的毒性作用的影响，以进一步探索马钱子应用于抗类风湿性关节炎的更为合理的炮制、提取和马钱子经皮给药系统制备方法，为马钱子的安全、有效利用提供科学依据。 　　1实验材料 　　1.1细胞 　　人永生化表皮细胞系，HaCaT细胞购自武汉细胞库。 　　1.2试剂与药品 　　马钱子碱对照品(中国食品药品检定研究院，批号110706-200505，纯度95.9%);士的宁对照品(中国食品药品检定研究院，批号110705-200306，纯度97%);马钱子碱纯品(南京泽朗植提技术有限公司，批号ZL110116，纯度97.2%);士的宁纯品(南京泽朗植提技术有限公司，批号ZL110120，纯度96.2%);马钱子总生物碱(本实验室自制，批含马钱子碱27.01%、士的宁26.95%、马钱子总生物碱67.38%);胎牛血清(杭州天杭生物科技有限公司，批号130624);MTT(sigama分装，批号M2128);BU-ANNEXINV-FITC凋亡试剂盒(BiouniquerTechnology公司，批号BUAP0102);PBS(吉诺生物医药技术有限公司，批;0.25%Trypsinamp;0.02%EDTA(吉诺生物医药技术有限公司，批;0.25%Trypsin(吉诺生物医药技术有限公司，批;RPMT1640培养液(吉诺生物医药技术有限公司，批;DMSO(吉诺生物医药技术有限公司，批号130815)。 　　1.3主要仪器 　　倒置相差显微镜(Leica);细胞培养箱(ThermoForma3111);全波长酶标仪(MDS4);流式细胞仪(EpicsAltra);紫外-可见分光光度计(UV-1600PC);液相检测器(LC-10AT);电子天平(PT-1004/205)。 　　2实验方法 　　2.1HaCaT细胞的培养 　　HaCaT细胞在37℃，5%CO2相对饱和湿度培养条件下，用含12%胎牛血清、青霉素(100U/mL)及链霉素(100mu;g/mL)的RPMI1640培养液培养，待细胞生长至对数期，用于给药试验。 　　2.2主要试剂溶液的制备 　　2.2.1马钱子总生物碱取马钱子总碱适量溶解于细胞培养液中，过滤除菌，HPLC测得含马钱子碱0.16mg/mL、士的宁0.16mg/mL，紫外分光光度法测定含马钱子总生物碱0.40mg/mL。4℃冰箱保存，备用。 　　2.2.2马钱子碱溶液取马钱子碱纯品溶解于细胞培养液中，过滤除菌，HPLC测得马钱子碱质量浓度为0.16mg/mL，4℃冰箱保存，备用。 　　2.2.3士的宁溶液取士的宁纯品溶解于细胞培养液中，过滤除菌，HPLC测得其质量浓度为0.16mg/mL，4℃冰箱保存，备用。 　　2.2.4马钱子碱士的宁混合物溶液取马钱子碱纯品、士的宁纯品溶解于细胞培养液中，过滤除菌，HPLC测得马钱子碱质量浓度为0.16mg/mL，士的宁质量浓度为0.16mg/mL，4℃冰箱保存，备用。 　　2.3重复性试验精密 　　吸取同一马钱子碱与士的宁的混合物含药培养液(含马钱子碱0.141mg/mL，士的宁0.101mg/mL)6份，每份0.5mL，用流动相定容至5mL，0.45mu;m微孔滤膜过滤，进样检测，计算得到马钱子碱和士的宁峰面积的RSD值分别为1.89%、1.60%。 　　2.4加样回收率测定 　　取马钱子碱