免疫组织化学与杂交组化原理和实验.pptVIP

⒉DNA 主要以双股链存在于细胞核内，其基本成分为碱基（A、G、T、C）、去氧戊（核）糖及磷酸。DNA的分子结构有三级：一级结构为长核苷酸单链；二级结构为双股核苷酸链组成的双螺旋模型；三级结构为超螺旋结构。 DNA的复制和转录均是在其双股链解聚成单链后，按照碱基互补规律（A-G，T-C，G-A，C-T或U-C，C-U） 进行的。链间的氢键能量相对较低，体外高温即可解链，这是核酸杂交的理论基础。 ⒊核糖核酸（RNA） 主要存在于细胞浆内，以单链的形式存在，由碱基（A、G、U、C）、戊糖和磷酸分子所组成，依其功能可分为四类：转运核糖核酸（tRNA）、信使核糖核酸（mRNA）、核蛋白体核糖核酸（rRNA）和小核核糖核酸（snRNA）。 ①tRNA 在细胞内含量居中，分子量较小，半衰期24h以上，细胞含量居中，是遗传信息翻译成蛋白质合成语言（氨基酸）的执行者，主要通过其反密码子与mRNA的相应密码子碱基配对，从而对模板mRNA携带的遗传信息实施氨基酸语言翻译的。 ②mRNA 是基因（DNA的一个片断）遗传信息的转录付本，蛋白质合成的模板，也是基因转录和表达功能检测的靶目标。其结构特点是分子量相对较小，性质极不稳定，半衰期很短（几分钟至数小时），细胞内含量最少，杂交检测样本组织要求必须新鲜。 ③rRNA 存在于粗面内质网表面的核蛋白体（ribosome）中，分子量较大，是细胞内含量最丰富的RNA，起执行蛋白质合成的“ 场所”和“ 装配机”的功能。? ④snRNA 存在于细胞核内的一类分子量相对较小的核RNA，含量微、种类多， 其功能可能与基因转录产物（hnRNA）的加工和修饰有关。 第五节 DNA的变性与复性 ⒈DNA变性 是指其双螺旋之间氢键断裂，即双股链解聚成单链的过程，体外条件下，高温（94°C）、改变溶液pH值或加入有机溶剂均可使DNA变性。 ⒉DNA复性 是指在一定条件下（温度缓慢冷却至55。C左右）， 变性解聚的二条互补单链又重新结合，恢复原来的双螺旋结构的过程，称为复性（renaturation）这一过程又叫退火（anneal）。 第六节 质粒与引物 ⒈质粒plasmid） 为细菌染色体外的小型双链环状的DNA，由于拥有特定的抗生素筛选序列和酶切位点，常用来作为克隆或重组真核细胞DNA（包括制备特异性核酸探针在内）的载体。质粒种类繁多，常用的有大肠杆菌质粒pBR322等。 ⒉引物（primer） 指PCR扩增特异性核酸（DNA或mRNA）序列时，在其两侧能与对应的模板链互补的寡核苷酸链。应用时一般要求成对，彼此序列方向相反（3′→5′，5′→3′），目的在于限定PCR扩增产物（DNA或mRNA序列）的特异性和长度，是一种PCR扩增反应的关键试剂。 *佐剂是一种非特异免疫增强剂，可增强免疫反应，提高抗体效价，常用福氏佐剂由85%石蜡油和15%羊毛脂组成（半佐剂），如加卡介苗(100ml佐剂中含卡介苗200 mg）则为完全佐剂（FCA）。一般首次注射时用其1/2体积与等量抗原进行乳化。 第二次或第三次注射时用不完全佐剂或不用佐剂。判断乳化是否充分，可将一滴乳化好的液体滴在水面上，如能长时间保持园珠形而不散开，表示乳化达到要求。 *半抗原的处理 半抗原只有免疫反应性而无免疫原性，半抗原必须与大分子载体结合才能激发机体产生抗体，常用的载体有血兰蛋白、卵白蛋白、牛血清白蛋白等。两者交联的方法和原理是： 利用-NH2，-COOH等功能基团，用戊二醛或碳化二亚胺（R′-N=C=N=R″）作为交联剂可将半抗原结合到载体上，其结合比例为5KD结合5—25个分子的小肽，交联完成后，还必须纯化与载体结合的半抗原。 ②动物的选择 选择什么动物来免疫取决于所需抗血清的量，小白鼠只能提供1.0-1.5ml的血液，而山羊却能提供好几升；其次看你有多少抗原用于免疫动物，小白鼠不到50微克就足够，而山羊却要几毫克； 另外，还要考虑动物的品系，免疫动物与提供抗原的动物之间的种系差异越大越好，比如哺乳动物的比较保守的蛋白抗原可选择非哺乳动物（鸡）来制备抗体。常用的动物有兔、羊、马、猪等，以兔（新西兰兔，要求：年青，健壮，体重在2.5公斤左右，雄性）为最常用。 ③免疫方法 *途径：可以肌肉、静脉、皮内、皮下或腹腔注射，一般以皮内注射效果最好，多部位比单部位好，大动物一般不用腹腔注射，颗粒抗原和使用佐剂时不能I.V.。另外还可用淋巴结内注射来免疫，此法可大大减少抗原用量。 *次数及间隔时间：次数一般为2-3次，首次注射后，10-15天再加强注射，剂量同首次或为首次的一半，用不全佐剂或不用佐剂；至于间隔时间，一般而言，动物越大，间隔越长，豚鼠、大鼠为7-8天；兔子为10-15天；羊为14