第4章 PCR技术的应用幻灯片.pptVIP

Gene splicing and mutagenesis by PCR-driven overlap extension Karin L Heckman Larry R Pease Nature Vol2 :924-928 核酸序列比对 /Blast.cgi BLAST分析界面 输入测序结果 结果界面之一 结果界面之二 九、PCR污染的产生及防治 PCR污染的监测 PCR强大扩增能力+检测的敏感性 经30个周期后，特定DNA片段的数量在理论上可增加109倍 极微量的污染便可导致假阳性，尤其对定量造成很大的问题 NTC (No Template Control): 必须设置一个不含模板DNA但含有PCR系统中所有其他成分的对照反应，这一对照管须在准备好所有其他PCR以后才进行吸加。 常见的PCR contamination 常规PCR 荧光定量PCR NTC 4 3 2 1 7 6 5 9 8 NTC 引起PCR污染的原因 模板间交叉污染 容器被污染 模板放置时, 由于密封不严溢于容器外 容器外粘有模板而造成相互间交叉污染 模板吸取过程中, 因气溶胶（aerosol）或其他原因引起移液器污染，从而导致交叉污染 引起PCR污染的原因 PCR试剂污染 PCR 试剂配制过程中, 移液器、容器、水等原因造成试剂被PCR 核酸模板污染。 引起PCR污染的原因 PCR产物污染-最主要最常见 PCR 产物拷贝量大，极微量的PCR产物污染, 就可形成假阳性。 移液器吸取PCR产物进行电泳检测，同一支移液器去准备PCR mix PCR产物的气溶胶污染： 一个气溶胶颗粒可能含几万个拷贝 气溶胶（aerosol）：悬浮于气体介质中粒径一般为 0.001μm~1000μm的固体、液体微小粒子形成的胶溶状态散体系。空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶, 在操作时比较剧烈地摇动反应管, 开盖时、吸样时及移液器的反复吸样都可形成气溶胶 引起PCR污染的原因 实验室中克隆质粒的污染 克隆质粒浓度高, 另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂, 其污染可能性也很大 防止PCR污染 首要原则 永远要设置NTC对照 如果不能在污染出现的第一时间发现，会导致严重的后果：一大段时间的数据不可信 准备PCR的移液器要专用 千万不能用吸取PCR产物/克隆质粒的移液器去准备PCR 体系 防止PCR污染 空间： 合理分隔实验区域:将样品的处理、配制PCR反应液、PCR循环扩增及PCR产物的鉴定等步骤分区进行，特别注意样本处理及PCR产物的鉴定应与其它步骤严格分开。 理想状态： 各个区域实验用品及移液器专用，实验前应将该区域用紫外线消毒，破坏残留的DNA或RNA。 防止PCR污染 操作 一旦进入吸加PCR试剂的专用场所并开始工作，就应戴上一副新手套，并应勤于更换。 准备专供自己使用的PCR试剂，分装为小份。不要与样品存放在一起。 选择质量好的Eppendorf管--密封性好且开管不需要太大力气。 打开离心管前应先离心，将管壁及管盖上的液体甩至管底部。开管动作要轻，以防管内液体溅出。 实验结束后及时清理台面。 防止PCR污染 移液器操作 由于操作时不慎将模板吸入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源，因而加样时要十分小心。 1）准备PCR的移液器专用 2）吸样要慢，吸样时尽量一次性完成，忌多次抽吸，切勿形成喷雾，以免交叉污染或产生气溶胶污染。 3）最好在加完所有其他反应成分后才吸加模板。 4）推荐在准备PCR过程中使用滤芯枪头 出现污染后解决办法 更换试剂 更换新的试剂和水，用确保无污染的移液器分装备用 清洁所有可能的污染源：实验台面、小离心机、冰箱门把手等等 1）实验台面、超净工作台用现配的3%双氧水或10%次氯酸钠溶液擦拭清洁。 2）或者用10%漂白粉溶液擦拭 3) 紫外光照射，照射距离应不超过90 cm，照射时间最好过夜。 实验过程中更加小心，采用前面提到的各种防止污染的办法 十、Colony PCR Cloning Cloning is the way in which we can take a single molecule, and make lots of bacterial cells that contain an identical molecule. These cells are clones, hence the name This used to be the only way to amplif