第十二章 遗传工程课件.pptVIP

人类对生物技术应用的安全性关注的方面包括是否会破坏环境，是否对人类健康有害，食品安全，以及宗教和伦理问题。 生物工程体的安全性评价是一个复杂的过程，包括生物工程体对生物群落的影响，对土壤动物和生物遗传多样性的影响，转基因通过花粉逃逸的问题，载体的安全性，食品的安全性等。 多个国家都对基因的安全性制定了相应的法规和判断标准。只有通过安全性评价的基因工程产品才允许投入生产。 安全性评价 * * * * * * * * * * * * 根据待选基因相关信息确定筛选方法和条件从基因库中筛选、分离基因。 多数方法是利用一段核苷酸序列(DNA、cDNA或寡聚核苷酸)或抗体作探针(Probe)，用放射性同位素或非放射性同位素标记探针筛选基因库。 筛库过程：将噬菌体感染形成的噬菌斑印影在硝酸纤维膜上变性，带有目的基因的放射性DNA或cDNA作探针进行杂交，放射性自显影杂交信号（黑点），对应的噬菌斑即为阳性克隆。 遗传工程 2．从基因库中分离特定的克隆序列(基因) 从基因库中筛选出阳性克隆 分析、鉴定 得到目的基因。 （1）. 核酸序列测定： 测定克隆后的DNA片段核酸序列 。 一般采用Sanger(1977)发明的双脱氧核糖核酸终止法测定核酸序列。 基因工程 3. 序列测定和分析 （2）. 核酸序列分析： 测定的核酸序列是否为基因、有什么功能，需用计算机软件或生物学实验进一 步分析。 ①.同源序列的分析：　* 同源性比较：　将待测序列在核酸和蛋白质两个水平上比较基因间的同源性，将序列发送到Blast等DNA Data数据库进行比较。　* 阅读框架的分析：　一个ORF是一条能编码一条多肽链的DNA序列，具有翻译起始信号和终止信号等。　cDNA 序列可分析内含子等。 ②.无任何同源性的新序列：　进行基因功能性研究的方法： * 将基因导入生物体进行基因失活或过量表达，根据表型推测基因作用； * 用噬菌体显现(phage display)技术； * 酵母双杂交系统进行蛋白质的功能分析。 遗传工程 （二）T-DNA标签克隆基因 基本原理： 利用T-DNA插入突变创造突变体，获得各突变体的纯合材料； 然后分析突变性状与T-DNA的共分离关系，存在共分离的材料用适当的PCR克隆技术获得T-DNA的侧翼基因组序列； 用其作探针筛选基因文库，获取目标基因或克隆，再进行下一步的分析 。 T-DNA 载体构建 ↓转化植物（T1，T-DNA杂合子)收获T2种子 ↓筛选T2，获突变子，应为3:1分离 ↓确定T-DNA与突变型共分离的个体 ↓产生纯合后代 ↓克隆T-DNA两侧的植物DNA ↓利用侧翼DNA序列作探针从该植物的cDNA文库中钓取基因 ↓基因功能的验证 （三）基于PCR的基因克隆： 聚合酶链式反应 (polymerase chain reaction PCR)可以体外快速扩增DNA。 美国Mullis(1986)发明 (现代生物学发展史上的里程碑)。PCR反应三个步聚 (一个循环)： 1. 变性：94－95℃使模板DNA双链变成单链 2. 复性：50－70℃下，引物分别与互补DNA单链互补配对； 3. 延伸：在引物的引导和Taq酶作用下，72 ℃下合成模板DNA的互补链。 PCR反应通常有25－35个循环，一般可扩增5kb左右的片段。 由该技术衍生出一些新的技术，如RAPD和AFLP等技术。 遗传工程 （四）人工合成基因： 根据已知的基因或氨基酸序列，将化学合成寡核苷酸的方法与酶促合成 DNA的方法结合起来可很快地人工合成基因。　　如SOE-PCR(sequence overlapped extension，SOE)技术可扩增出完整的基因序列。 　　1. 化学合成的寡聚核苷酸(80－100个核苷酸)通过SOE将单链部分补齐；　　2. PCR扩增DNA片段；　　3. DNA变性；　　4. 两个单链部分经SOE补齐双链；　　5. PCR扩增DNA，利用多级SOE-PCR 扩增出完整的基因。 遗传工程 第 3 节 外源基因导入受体 一、重组DNA导入原核生物（细菌） 二、植物表达载体 三、外源基因导入植物 一、重组DNA导入原核生物（细菌） CaCl2处理转化。CaCl2处理转化的机制尚不清楚，可能是CaCl2处理破坏了细菌的细胞壁，使游离的DNA分子被摄入受体细胞。这种方法的转化频率大概是千分之一。 电激转化（electroporation）。是目前常用的一种转化方式。在电转化仪施加的强电场的作用下，使受体细胞细胞壁具有可逆的电穿孔，DNA分子进入细胞。 结合（conjugation）。