高效液相色谱法课件.pptVIP

* 二、流动相 由于高效液相色谱中流动相是液体，它对组分有亲合力，并参与固定相对组分的竞争，因此，正确选择流动相直接影响组分的分离度。对流动相溶剂的要求是： （1）溶剂对于待测样品，必须具有合适的极性和良好的选 择性。 （2）溶剂与检测器匹配。对于紫外吸收检测器，应注意选 用检测器波长比溶剂的紫外截止波长 要长。所谓溶剂 * 梯度洗脱时选择溶剂应注意： ①要注意溶剂的互溶性。 ②梯度洗脱所用的溶剂纯度要求更高，以保证良好的重现性。 ③混合溶剂的粘度常随组成而变化，因而在梯度洗脱时常出现压力的变化。 ④每次梯度洗脱之后必须对色谱柱进行再生处理，使其恢复到初始状态。 * 二、进样系统 进样系统包括进样口、注射器和进样阀等，包括自动进样器。它的作用是把分析试样有效地送入色谱柱上进行分离。进样装置要求：密封性好，死体积小，重复性好，保证中心进样，进样时对色谱系统的压力、流量影响小。 1．隔膜进样。用微量注射器将样品注入专门设计的与色谱柱相连的进样头内，可把样品直接送到柱头填充床的中心，死体积几乎等于零，可以获得最佳的柱效，且价格便宜，操作方便。但不能在高压下使用（如10MPa以上）,而且能耐各种溶剂的橡皮不易找到，常规分析使用受到限制。 2．停流进样。可避免在高压下进样。但在HPLC中由于隔膜的污染，停泵或重新启动时往往会出现鬼峰；另一缺点是保留时间不准。在以峰的始末信号控制馏分收集的制备色谱中，效果较好。 3．阀进样。一般HPLC分析常用六通进样阀（以美国Rheodyne公司的7725和7725i型最常见），其关键部件由圆形密封垫（转子）和固定底座（定子）组成。由于阀接头和连接管死体积的存在，柱效率低于隔膜进样（约下降5~10%左右），但耐高压（35~40MPa），进样量准确，重复性好（0.5%），操作方便。 进样阀 六通阀设计 耐高压，低死体积 可以手动或自动旋转进样阀 自动进样的重复性优于手动进样 手动进样阀的进样 注意：一定使用平头微量进样针 进 样—层 流 效 应 当样品注入定量环时，环中的流动相将被取代 样品于流动相之间的界面呈抛物线状，称为层流效应 全定量环进样时，必须考虑层流效应的影响 进 样—层 流 效 应 以定量环的体积定量 对一般样品而言，进样体积需大于定量环的2.5倍 4 倍则更加保险 倍数 进 样—进 样 量 全定量环进样 准确，但浪费样品 至少需要2.5倍进样体积的样品 部分定量环进样 进样量 进样环体积的一半 无层流效应的影响 误差来源于进样针及操作人员 使用内标法将可以提高进样的准确度 * 三、分离系统 分离系统包括色谱柱、恒温器和连接管等部件。色谱柱一般用内部抛光的不锈钢制成。 色谱柱按用途可分为分析型和制备型两类，尺寸规格也不同：①常规分析柱（常量柱），内径2~5mm（常用4.6mm，国内有4mm和5mm），柱长10~30cm；②窄径柱（narrow bore，又称细管径柱、半微柱semi-microcolumn），内径1~2mm，柱长10~20cm；③毛细管柱（又称微柱microcolumn），内径0.2~0.5mm；④半制备柱，内径＞5mm；⑤实验室制备柱，内径20~40mm，柱长10~30cm；⑥生产制备柱内径可达几十厘米。柱内径一般是根据柱长、填料粒径和折合流速来确定，目的是为了避免管壁效应。 * 柱的使用注意事项 ? ①　避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。 ②　应逐渐改变溶剂的组成，特别是反相色谱中，不应直接从有机溶剂改变为全部是水，反之亦然。 ③　色谱柱不能反冲，否则会迅速降低柱效。 ④　选择使用适宜的流动相（尤其是pH），以避免固定相被破坏。。 ⑤　避免将基质复杂的样品尤其是生物样品直接注入柱内，需要对样品进行预处理或者在进样器和色谱柱之间连接一保护柱。 ⑥　经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内的杂质 ⑦　保存色谱柱时应将柱内充满乙腈或甲醇，柱接头要拧紧，防止溶剂挥发干燥。绝对禁止将缓冲溶液留在柱内静置过夜或更长时间。 四、检 测 器 作用：检测色谱柱流出物组份浓度的变化 理想的检测器： 灵敏度高 重复性好 不引起柱外谱带扩展 线性范围宽 死体积小 检测器响应对流量及温度变化不敏感 检 测 器 分 类 按检测对象分类 整体性检测器：检测流动相的总体物理性质 如：示差折光检测器、电导检测器 灵敏度低、易受温度影响的波动、不适合梯度洗脱 溶质性检测器：测量溶质的某种特性或物化性质的变化 如：紫外检测器、荧光检测器 流动相不能有紫外吸收 按选择性分