人白介素18(IL18)RGD模体抗黑色素瘤总汇.doc

人白介素18(IL18)RGD模体抗黑色素瘤 细胞B16活性研究 卢忠民赵宝昌* （大连医科大学 生物化学和分子生物学教研室大连116027） 摘要利用定点突变及DNA重组技术，在人白细胞介素18(IL18)的cDNA序列中插入了GGC序列，使IL18第39精氨酸残基和第40天冬氨酸残基之间插入一个甘氨酸残基，从而构建了RGD模体。此重组的cDNA序列构建入表达质粒pPIC9K，并转化Pichia Pastoris酵母GS115，利用表达系统进行了高效表达。用Sephadex G100凝胶过滤纯化表达产物，获得初步纯化的蛋白。研究表明，IL18在体外对黑色素瘤细胞株B16没有作用，而IL18RGD抑制作用明显，IC50 = 810μmol/L；应用小鼠动物模型研究结果显示，IL18及IL18RGD均对黑色素瘤细胞B16有抑制作用，且IL18RGD比IL18的作用强；同时,对鸡胚绒毛尿囊膜(chicken chorioallantoic membrane,CAM)血管生成的抑制实验发现， IL18RGD 对CAM血管生成的抑制作用也比IL18强。但IL18RGD仍保存对PBMC诱导产生IFNγ能力。结果提示，IL18RGD在具有抗炎，抗感染作用的同时增添了抑制肿瘤血管新的功能。 关键词IL18RGD模体毕赤酵母B16细胞 中图分类号Q5184 收稿日期：20050125修回日期：20051222 * 通讯作者，电子信箱：zhaobc99@mail.dlmedu.edu.cn1995年,Okamura等［1］首次在Nature上报道了IL18，该种因子具有强烈的IFNγ诱生能力，继而研究发现它具有多种生物学功能［2］。IL18的产生具有多源性，体内多种细胞均可产生IL18，例如NK细胞、Th1细胞、皮肤胶质细胞、活化的巨噬细胞和B细胞等。IL18还具有增强NK和CTL细胞活性、促进T细胞增殖、诱发Th1、Th2类细胞因子产生，促进免疫细胞表达FasL、增强Fas介导的细胞毒作用［1~3］。 国内张国荣等［4］应用动物模型研究证实IL18具有较强抑制实体瘤生长的能力； Hiroshi 等［5］将IL18的基因转入B16黑色素瘤内进行表达明显抑制肿瘤细胞的生长。上述结果说明 IL18在抗肿瘤、抗感染方面具有潜在的应用价值。 RGD肽是一类含有ArgGlyAsp序列的肽类，关于RGD肽的研究已从抗血小板聚集作用侧重到抑制肿瘤细胞粘附、抗肿瘤细胞转移和抗肿瘤新血管生成等方面，干扰肿瘤细胞的侵袭、迁移过程。鉴于此，我们对IL18进行改造，构建了RGD模体，以增加其抗肿瘤血管新生的生物活性。 1材料与方法1.1材料 1.1.1菌株和质粒大肠杆菌DH5α、毕赤甲基营养酵母GS115、pPIC9K酵母表达载体、重组人IL18 cDNA均由本实验室保存，pPIC9KIL18由本实验室构建。 1.1.2细胞株及实验动物来源B16黑色素瘤细胞购自中国科学院上海细胞库,DMEM细胞培养液购自GIBCO BRL，C57BL/6小鼠购自大连医科大学实验动物中心。 1.1.3主要试剂限制性内切核酸酶、Taq聚合酶、T4 DNA连接酶、PCR Fragment Recovery Kit、Agarose Gel DNA Purification Kit、MiniBEST Plasmid Purification Kit均购自大连宝生物工程有限公司；鼠抗人IFNγ单克隆抗体、ConA购自Sigma公司；Sephadex G100购自Amersham Pharmacia Biotech公司，辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG为华美生物高科技有限公司产品；IFNγ标准品为上海克隆生物高技术有限公司产品；ADP为Amresco产品；碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor,bFGF）购自PEPROTECH EC LTD；四甲基偶氮唑盐(MTT)为Amresco产品, 其他试剂均为国产分析纯。 1.2方法 1.2.1IL18RGD的构建SOE引入位点特异突变，应用重叠延伸剪接法(splicing by overlap extension, SOE)引入位点特异突变来构建IL18 RGD模体的特有碱基序列，4条引物分别为：a:5′GCACAAATAACGGGTTATTG3′；b:5′GACTGACACCGCTATTACGTGGGGCC3′；c:5′GGCGATAATGCACCCCGGACCAT3′；d:5′ATGCGGCCGGTCTTCGTTTTGAACAGTG3′。 首先，用质粒提取试剂盒抽提pPIC