第九章基因分离与克隆-技术分析.ppt

pUCm-T克隆载体图谱 1．当一DNA片段插入终止子探针型载体pBU10的HindⅢ克隆位点后，重组质粒仍可转化E.coli (CmlsTcs) 为CmlrTcr ，为什么? 可设计什么实验证明其假设? 2．当一DNA片段插入pUC18后，在x-gal平板上出现两类菌落，兰色菌落和白色菌落。从白色菌落中分离纯化的质粒经电泳检查，均比原载体DNA分子大；但从兰色菌落随机分离的质粒DNA却有两类，其中一类与载体大小相同，另一类却与白色菌落中分离的质粒大小相同。如何解释这一实验结果? 可设计何种实验证明你的解释是正确的? 3．当把一外源DNA插入一克隆载体后，重组DNA分子转化E.coli 细胞所获得的重组子分子可根据其限制酶图谱分为两类，即这两类转化子中所含的重组DNA分子的限制酶图谱不一样，从这两类转化细胞中分离到的重组DNA分子可用限制酶回收插入的片段。而从这两类转化细胞培养液所分离到的DNA却 思 考 题 不能用限制酶回收该片段。当把同类转化细胞培养液所分离到的DNA进行复性分析时，DNA分子间不会发生复性，但把从不同类转化细胞培养液分离到的DNA进行同样的实验时，发现在电镜下可观察到十分类似于8字形的结构。如何解释上述实验结果? 可利用图示法解释。 4. 由于分子克隆载体的大小决定外源DNA插入片段的大小，两者呈反比关系，因而在建立载体时千方百计地减小载体分子量。对于穿梭载体，因为复制起点和标记基因具有生物特异性，所以载体上需要同时具有两个以上的复制起点和标记基因。已知不同生物的某些基因启动子可以在E.coli细胞中启动基因转录，问可以采取一些什么方法减小穿梭载体的分子量? * * * ⑵ 免疫结合法 噬菌斑转印到硝酸纤维膜上，各种cDNA表达并呈现在噬菌体表面的蛋白质便牢固地结合在膜上。然后将膜放入含有特异抗体的溶液中进行免疫结合反应，洗去未结合的抗体后，再与125 I 标记的第二抗体结合, 从而找出带有放射性示踪信号的斑点, 进而找出对应噬菌斑, 克隆扩增, 提取DNA后经酶切可获目的基因。 基因组文库 cDNA文库 信息供体 DNA mRNA 载体 噬菌体，黏粒，人工染色体 质粒，噬菌体 连接前 部分酶切，分级分离 反转录合成cDNA双链 连接 粘端连接，人工接头 同聚物加尾，人工接头 筛选 核酸探针 核酸探针，免疫探针 基因组文库和cDNA文库的比较 组织 可克隆之DNA 载体 DNA cDNA mRNA 部分酶解DNA DNA长度分级 双链cDNA DNA与载体连接 引入宿主细胞 鉴定文库的完备性 扩增后供长期储存 筛选出所需要的克隆 应用差别杂交法构建cDNA文库 适用于分离经特殊处理而被诱发表达的cDNA克隆； 技术基础：在一个细胞群体中目的基因正常表达，在另一个细胞群体中目的基因不表达； 可以通过这两种总mRNA（cDNA拷贝）为探针的平行杂交，对有目的基因表达的细胞总mRNA构建的克隆库进行筛选。 四、获得目的基因的其他方法 差示筛选（Differential Screening） 构建差示文库筛选特殊基因。 差示文库（differential library）又称扣除文库（ subtracted library）, 是反映不同组织细胞或同一种细胞在不同生理状态下,基因表达差异的cDNA文库。 2. 应用扣除杂交法构建cDNA文库 不是细胞内所有表达基因全体的集合，而是主要含差异表达基因的部分cDNA的集合； 用过量的参照细胞mRNA或cDNA与目的细胞cDNA或mRNA(又称目的序列)杂交，形成的RNA-cDNA杂交体是两种细胞共有的，将其扣除；剩下的cDNA或mRNA可以标记成探针(称减法或扣除探针)，从上述目的细胞的cDNA文库中筛选目的克隆； 实质上是除去了一大批高丰度非特异性的cDNA，含有的是特异表达的cDNA克隆及其它一些低丰度mRNA的cDNA克隆。 扣除杂交（Subtractive Hybridization） 扣除杂交法基本程序 利用两组细胞mRNA种类的差异，分离克隆差异mRNA所对应的cDNA，因而这种程序较适用于分离克隆新基因。 例如：正常的大鼠FR3T3成纤维细胞中，有些新基因是不能自发表达的，需在多瘤病毒感染之后方可