活细胞成像设备的选择技术分析.docx

为活细胞研究设计光学显微系统时，首要考虑的是检测器的敏感度（对信号乃至噪音的检测），图像获取的速度，以及在此基础上标本的可行性。对于固定细胞的成像，曝光时间及光强度相对来说都很高，这时可能会造成光漂白；然而对于活细胞成像，上述光的影响必须去除。几乎在所有情况下，活细胞显微镜都会在尽可能高的图像质量与尽可能好的细胞活性之间取得一个平衡。对于此类实验，时间及空间上的分辨率需要设定在能满足实验要求的水平上，而不是给予过度的光照或设定过多采样时间点。??基本上,一个理想的活细胞成像系统必需有足够的敏感度，来满足在弱荧光条件下仍能得到高图片质量；同时，系统也必需足够快，以记录整个动态过程。?另外，这个系统还需要有足够高的分辨率以捕捉样品细节，并且能够准确的实时测量每个微小的光强变化。然而不幸的是，要改善上述的任意一条都需建立在牺牲其它性能的基础上。因此现在还不能够设计出一个可以满足所有要求的活细胞成像体系。研究人员现在只能在尽量减低不重要的信息的遗失的同时，尽可能的获得最优的重要参数。这样，显微镜的配置最终取决于成像的要求，对于样品在实验期间活性的要求，进行标记的难度水平，以及仪器的可用性等实际因素。如图一（Figure 1）所示为一台倒置研究级显微镜，它配有四个相机接口，并可满足对培养的组织的研究。在四个接口上分别配有四个不同的相机，每一个都用来获取不同的图像。在大多数情况下，这种显微镜的分光设计是100％进入相机或以80：20的比例同时分配给相机和目镜。在弱光成像时，研究人员必需确保将最敏感的相机接在100％分光口上。在图一中，彩色CCD（Full color CCD）接在显微镜的底部（a），它从物镜接受的光信号不经过棱镜或反光镜的反射。这样的相机通常用来进行多色荧光或明场拍摄。显微镜右侧连接高效的电子倍增电荷偶联设备（Electron Multiplying Charge Coupled Device，EMCCD）（b），它通常用来检测极弱的荧光信号。接在显微镜左侧的相机（c）配有一个高量子效应的感应器，可以感应700－1000nm?波长范围内的光，所以这个相机可以用来进行微分干涉相称（differential interference contrast，DIC）观察方法下厚标本的红外线照明成像。最后，对于高分辨率的单色荧光成像，如全内反射荧光或其它荧光技术，图一中的显微镜在前部（d）配备了Peltier-cool?相机。这个相机最小像素点为6μm，适合于此类成像的需求。如图一中的配置非常昂贵，但是它能满足用户所有的成像要求。进行活细胞成像的光学显微镜需要宽光谱增称模块。大多数的研究者使用荧光显微镜，通常还会配合一种或多种透射光技术。其中荧光技术包括了传统的宽视场落射荧光，激光扫描共聚焦，真空碟片共聚焦，场扫描共聚焦，多光子，全内反射（TIRF），荧光关联光谱，荧光寿命成像（FILM），光活化，镭射陷阱等技术。相应的成像技术有光谱成像，多色成像，共定位，时间序列，荧光光漂白恢复，（FRAP，FLIP，FLAP），荧光共振能量转移（FRET），荧光散斑显微镜，膜片钳技术等，以上这些技术通常要配合一种或多种基础成像技术。当荧光与明场,DIC,霍夫曼调制相称(HMC),相差等技术相结合时,荧光技术作为探针,可用于定位.对于绝大多数的活细胞成像来说,显微镜的配置都需要满足一些特定的需要以保证试验能够成功进行。除了显微镜与数字成像系统，活细胞成像还需要考虑到两个限制因素——一个是保持细胞的活性，另一个是在北京噪音及自发荧光的基础上尽可能的提高信号强度。提高活细胞成像的信噪比活细胞成像与固定细胞成像之间的基本区别是，后者的成像没有过多的限制，?如合适视野的选定，曝光时间的设定，电子益增的设定，读出率及,偏移值等。这样，染色的固定样品的成像就可以充分利用相机的全部动态设定。因此，固定成像可以得到理想的信噪比。但不幸的是，由于细胞活性对照明的严格要求，活细胞成像的情况又与固定细胞的成像有所不同。在活细胞成像时，样品的灰度往往比背景高不了多少。在这种情况下，成像首要考虑的是检测系统的暗电流及噪音值。经济型的相机通常噪音都会比较高，导致背景混乱并掩盖样品信号，在读出速率增加时这种影响更为严重。所以，几乎所有的活细胞成像设备质量的衡量标准都是检测器的好坏。数字图像的噪音主要由四方面造成，检测器，照明系统，Poisson?噪音或shot?噪音（由于光子通量的随机性造成），以及弥散光。在大多数情况下，通过选择好的检测器或优化照明条件可以降低系统噪音。事实上，任何一种光子检测器在记录的时候都会产生某种形式上的噪音。扫描光聚焦及多光子显微镜中的光电倍增管（PMT）会产生杂电子。同样的，用于明场，全内反射，针孔碟片共聚焦，场扫描显微镜的CCD也会生成背景暗电流。