医学检测-产前技术分析.docx

以下是简单整理的东西 产前实验流程解析 .血浆分离 .DNA提取 .文库构建 主要内容: 血浆分离 实验流程: 1.预冷离心机。 2.将全血按同的医院代码分类，记录各医院全血的流水号，然后置于4℃冰箱暂存。 3.待离心机预冷至4℃，将全血样品置于离心机中（离心时注意严格配平），1600g离心10min。此过程可准备实验需要的中转管和最终管。 4.离心完成后吸取上清液平均分到2个或多个已编号的2.0mlEP管中，注意核对样本编号及能吸到白细胞和红细胞，此过程需要在冰盒上操作，并严格对号。 5.将上一步得到的血浆置于预先冷却至4℃的离心机，16000g离心10min，离心后将上清转入新的已编号及贴好血浆条码2.0 mLEP管中，至少保证前3管体积为600ul，此过程同样需要在冰盒上操作，并严格对号。 6.分离完成后制作产前血浆分离反馈表. 注意事项 1.全血样本必需在离体8小时内分离完血浆。 2.必需保证样本在低温条件下离心，离心时应严格配平。 3.开启EP管盖时，注意能碰到EP管内盖。 4.血浆分离结束后，若短期内无法将样本送往配送组入库，必需将样本置于-20 ℃冰箱中暂存。 5.离心机使用结束后应及时关掉电源。 6.吸取上清时慢吸慢打，吸到中间层的白细胞，若吸到白细胞应将全血重新离心。 7.去DNA清洗液为酸性溶液，能用于清洗离心机转子，以免腐蚀转子。 8.实验所用EP管架需定期用1 %盐酸浸泡过夜后洗净再使用。 9.若实验室未配制DNA清洗液，可用10 %次氯酸钠代替，使用方法同DNA清洗液。 问题 问：第一步离心后，从采血管内吸取血浆时，吸到白细胞和红 细胞，怎么处理？ 答：重新离心5-10min 问:为什么要严格要求第一步分离血浆时能吸到中间层的白细胞和红细胞？ 答：由于第二步高速离心会使得有核细胞破裂，造成人体基因组DNA的释放，母体DNA背景过大，从而影响实验结果。 问：为什么无创产前基因检测样品类型是血浆而选用血清？ 答：血清是添加抗凝剂而通过自体纤维蛋白原和凝血因子分离出来的上清液，血浆则是添加抗凝剂后析出的上清液。血清在血凝块收缩时会导致细胞内DNA的释放，导致母体背景DNA过大，影响实验结果，而血浆内基质更稳定，可保存时间更长。 DNA提取 原理： 在高盐低pH的条件下通过硅胶膜特异吸附，将裂解液中的DNA吸附到硅胶膜上，去除杂质后用低盐洗脱液洗脱得到吸附在膜上的DNA。 天根试剂盒DNA提取简易流程 600 μL血浆+10 μL蛋白酶K 加入600 μLGBmix（GB：carrier RNA=1mL：10μL），混匀 56℃水浴10 min，取出后冷却5min，短暂离心 加入300 μL冷冻无水乙醇，轻轻颠倒混匀 将混合液转入提取柱中，8000rpm离心30s 弃滤液，加入500 μLGD，8000 rpm离心30 s 弃滤液，加入500 μLPW，8000 rpm离心30 s（重复1次） 弃滤液，12000 rpm离心2min 将提取柱放在1.5 mL离心管上晾干3 min 加入90μL（其中5 μL为损耗）TB溶解5 min，12000 rpm离心2 min QIAGEN试剂盒DNA提取简易流程 600 μL血浆+10 μL蛋白酶K 加入600 μLALmix（AL：carrier RNA=1mL：10μL），混匀 56℃水浴10 min，取出后冷却5min，短暂离心 加入300 μL冷冻无水乙醇，轻轻颠倒混匀 将混合液转入提取柱中，8000rpm离心30s 弃滤液，加入700 μLAW1，8000 rpm离心30 s 弃滤液，加入500 μLAW2，8000 rpm离心30 s 弃滤液，12000 rpm离心2min 将提取柱放在1.5 mL离心管上晾干3 min 加入90μL（其中5 μL为损耗）AE溶解5 min，12000 rpm离心2 min 提取试剂的作用 蛋白酶K：裂解蛋白，核酸释放 GB缓冲液：裂解细胞、提供稳定的高盐环境 Carrier RNA：提高DNA不吸附柱上硅胶膜的结合，从而提高DNA的产率 无水乙醇：沉淀DNA GD：去除蛋白等杂质 PW：去除盐离子等杂质 TB:溶解回收DNA 实验细节 1.GBmix配制加入carrierRNA之后，必须在瓶壁上标 志并写上配制日期。 2.GD、PW配制时，加入无水乙醇后，必须在瓶壁上标志并写上配制日期。 3.实验过程中加入GBmix、GD、PW之前应先检查是否加入了carrierRNA或者是否加入无水乙醇。 4.倒扣套管用到的吸水纸要足够厚度，厚度以倒扣后废液渗过最后一层吸水纸为准；倒扣时，动作要轻柔，许磕管，同的样本许扣在同一个位置上。 5.倒掉废液时，能接触吸附柱中间及