第三章细胞生物学方法技术分析.ppt

2　细胞组分的分析方法 离心分离技术 不同的细胞器和分子有不同的体积和密度，可在不同离心力的作用下沉降分离。常用的两类离心分离方法是速度离心(velocity centrifugation)和等密度离心(isodensity centrifugation) 蔗糖或者甘油(它们的最大密度是1.3g/cm3)通常可用于分离膜结合的细胞器，如高尔基体、内质网、溶酶体和线粒体。 离心分离密度大于1.3g/cm3的样品，如DNA、RNA，需要使用密度比蔗糖和甘油大的介质。重金属盐氯化铯(CsCl)是目前使用的最好的离心介质，它在离心场中可自行调节形成浓度梯度，并能保持稳定。在氯化铯形成的密度梯度中，离心管顶部的密度为:1.65g/ cm3，底部为:1.75g/ cm3。因为DNA的密度是1.70g/ cm3，会停留在离心管的中部)。 不同的细胞器、大分子和病毒的密度及相应的沉降系数 差速离心(differential centrifugation) 主要是采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的细胞器。起始的离心速度较低，让较大的颗粒沉降到管底，小的颗粒仍然悬浮在上清液中。收集沉淀，改用较高的离心速度离心悬浮液，将较小的颗粒沉降，以此类推，达到分离不同大小颗粒的目的 等密度离心 离心适当时间，样品中的颗粒向管底部移动，由于体积的不同，移动的区带速度不同。常用的介质有蔗糖、多聚蔗糖、氯化铯等 CsCl 密度梯度离心 重金属盐氯化铯(CsCl) 在离心场中可自行调节形成浓度梯度，并能保持稳定 ，用于分离不同密度的细胞组分。 层析分离技术(chromatography) 层析是广泛使用的分离蛋白质的方法，它是根据蛋白质的形态、大小和电荷的不同而设计的物理分离方法。 目前最常用的层析方法有 凝胶过滤层析 离子交换层析 亲和层析等 凝胶过滤层析(gel filtration chromatography) 又称排阻层析或分子筛方法，主要是根据蛋白质的大小和形状，即蛋白质的质量进行分离和纯化 亲和层析(affinity chromatography) 当要被分离的蛋白混合液通过层析柱时，与吸附剂具有亲和能力的蛋白质就会被吸附而滞留在层析柱中。那些没有亲和力的蛋白质由于不被吸附，直接流出，从而与被分离的蛋白质分开 离子交换层析(ion-exchange chromatography) 不同的蛋白质有不同的等电点，在一定的条件下解离后所带的电荷种类和电荷量都不同，因而可与不同的离子交换剂以不同的亲和力相互交换吸附。 2.2　细胞组分的显示方法 2　细胞组分的分析方法 2　细胞组分的分析方法 基因工程技术(gene engineering) 基因工程是以分子遗传学为理论基础， 以分子生物学和微生物学的现代方法为手段， 将不同来源的基因(DNA分子)，按预先设计的蓝图， 在体外构建杂种DNA分子， 然后导入活细胞， 以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、 生产新产品。基因工程技术为基因的结构和功能的研究提供了有力的手段 选择性基因敲除(gene knockout) 是指一个有功能的基因通过基因工程方法完全被剔除的人工突变技术。人为的将小鼠的某一种有功能的基因完全缺失的技术就称为基因敲除技术。 应用于几种遗传病的研究，还可用于研究特定基因的细胞生物学活性以及研究发育调控的基因作用等 转基因敲除小鼠的获得 2　细胞组分的分析方法 2　细胞组分的分析方法 3　细胞培养与细胞工程 3　细胞培养与细胞工程 贴壁培养 分散的细胞悬浮在培养瓶中很快(几十分钟至几小时)就贴附在瓶壁上， 称为细胞贴壁， 贴壁后的细胞形态形成多态性， 呈单层生长， 所以此法又叫单层细胞培养。单层培养的细胞保持接触抑制(contact inhibition)的特性。 3　细胞培养与细胞工程 植物原生质体培养 3　细胞培养与细胞工程 3　细胞培养与细胞工程 3　细胞培养与细胞工程 3　细胞培养与细胞工程 动物细胞核移植克隆技术 1997年，英国苏格兰罗斯林研究所I.WI.Wilmut等首次成功通过细胞融合技术利用成年动物彻底分化的体细胞克隆出子代个体，开创了动物体细胞克隆的新时代。 乳腺生物反应器技术 乳腺生物反应器是根据细胞生物学中蛋白质合成与分选的机理，结合基因工程技术、动物转基因技术等，利用动物的乳腺分泌某些具有重要价值的基因产物 用转基因绵羊生产重要的医用蛋白质 四、 细胞及生物大分子的动态变化 1 荧光漂白恢复技术 3、放射自显影技术 放射自显影技术是用感光胶片测定细胞内某种被放射性标记的物质在细胞固定时所在的位置，基本过程如右图所示。 对细胞生命活动的研究成为当今生命科学发展的瓶颈 第3章作业 4.6