第十二章基因组技术技术分析.ppt

第十二章 基因组研究技术 基因组一词(genome)系由德国汉堡大学植物学教授汉斯.温克勒于1920年首创 一个生物的基因组蕴含了该生物体全部的遗传信息，即为整套染色体所含有的全部DNA序列 现代基因组测序技术迅猛发展，已产生许多物种庞大的基因组序列信息 基因组学（genomics）以基因组序列数据为出发点，从整体水平上研究基因的存在、结构与功能、基因间相互关系，甚至于染色体分子水平的结构特征以及不同物种基因组之间的进化关系等，最终系统地解码生命 第一节 传统基因组研究技术 在基因组学新兴之初，获得生物体基因组DNA序列 是研究关注的焦点 基因组测序基本策略：整个基因组DNA随机打断——各小片段逐一测序——按位置关系排列组装各测序小片段 基因组图谱精确指导测序拼接： 遗传图谱、物理图谱、序列图谱和功能图谱 一. 基因组遗传图谱的构建 遗传作图（genetic mapping）是对某个未知真核生物基因组中的遗传信息（或者是控制某个性状的基因）在染色体上的位置和分布状况进行初步确定 1. 遗传作图标记 标记 位于染色体上 易于检测识别 个体间多态性 稳定遗传 形态标记 DNA标记 限制性酶切片段长度多态性（RFLP） 简单序列长度多态性（SSLP） 单核苷酸多态性（SNP） 2. 遗传作图的方法 （1）遗传作图的遗传学原理 孟德尔遗传学的连锁和交换定律 基因交换频率与在染色体上的间隔距离成正比 利用重组率判断基因在染色体上相对位置 （2）不同模式生物的连锁分析 有性杂交实验连锁分析 系谱分析作图 细菌（无减数分裂）——转化、转导和结合转 移频率 二. 基因组物理图谱的构建 遗传图的分辨率有限 遗传图的覆盖面较低 遗传分子标记排列有时会出错 1. 限制性作图 在基因组上标定限制性酶切位点的相对位置 主要适合对小基因组的原核生物和大片段进行限制性位点分析 2. DNA大片段重叠克隆的基因组作图 先构建基因组的大片段基因文库 然后根据克隆片段之间的重叠顺序构建重叠群(contig)，从而绘制物理连锁图 3. 荧光标记原位杂交作图 fluorescent in situ hybridzation，FISH 通过荧光标记的探针与染色体杂交，从而确定分子标记在染色体上的实际物理位置 4. 序列标签位点作图 sequence tagged site，STS 通过PCR或分子杂交将序列标签小段DNA序列在基因组DNA中进行定位 可用于构建最为详细的大基因组物理图 5. 基因组光学图谱——OpGen公司开发 光学图谱：来源于细菌、酵母或者真菌的单个基因组DNA分子有序、高信息含量的限制性酶切位点的图谱 做法： （1）温和裂解细胞，抽提长的基因组DNA分子 （2）微流体装置将单个DNA分子在光学芯片上锚成平行阵列 （3）原位限制性消化锚定DNA分子并染色 （4）分析软件测量酶切产生片段大小和顺序 （5）光信号转换成数字信号，获得单分子光学图谱 三. 基因组测序 1. 大规模基因组测序方法学改进 454测序技术、Solexa测序技术、SOLiD测序技术和单分子测序技术（具体测序原理见第九章） 2. 基因组DNA序列的确定 （1）通过鸟枪法拼接序列 染色体DNA随机打断成小片段——测序小片段——检测短序列间可能的重叠区——逐级拼接、推导出完整序列 （2）克隆重叠群法测序技术 在鸟枪法基础上发展起来 3. 人类基因组测序 人类基因组计划1999年正式实施，2003年全部完成 国际人类基因组测序协调组：图谱测序方法（物理图谱、鸟枪法） 美国Celera Genomics公司：全基因组鸟枪法 两种测序结果和分析：2001年发表在Nature和Science杂志上 第二节 现代基因组研究技术 随着生命科学领域技术的飞速发展，只停留在传统基因组学时代里获得生物全基因组序列、重点关注单个或少数基因表达调控，已满足不了科学发展的需要 后基因组时代使命：把一个基因组或一类基因组作为一个独立单位，来研究众多基因是如何精妙地组织构成基因组、基因组之间的进化关系和演化方向以及基因组仅靠静态的核酸序列是如何在瞬息万变中有条不紊地指挥生命的。 一. 基因组序列的解读 1. 通过序列分析查找基因 ⑴ 寻找基因的开放阅读框 Getorf：FASTA输入格式http://bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces/getorf.html ⑵ 借助序列的同源性寻找基因 常用软件：TWINSCAN(Korf Ⅰ等，2001)和SGP2(syntenic gene prediction tool)(Parra