第十三章细胞衰老与凋亡技术分析.ppt

教学目的：1． 掌握细胞衰老与凋亡的概念 2 ． 探讨细胞衰老及凋亡的机理教学重点： 1．细胞衰老与凋亡的表现 2 ．细胞衰老与凋亡的机理 教学难点：细胞衰老与凋亡的机理 要点综述 细胞凋亡是本章的重点内容。由于细胞凋亡在有机体生长发育过程中具有极其重要的意义，对它的研究受到了广泛的关注，是近几年来的一个研究热点。要求掌握细胞凋亡的研究进展，包括细胞凋亡的形态和生化特征、分子机制和检测方法等。 衰老和死亡是生命的基本现象，衰老过程发生在生物界的整体水平、种群水平、个体水平、细胞水平以及分子水平等不同的层次。 第十三章 程序性细胞死亡与细胞衰老 考点分析 细胞衰老部分的内容在各院校历年考题中鲜有出现，考察内容集中于细胞凋亡上。考察的重点也多为基础知识及检测方法，另外还涉及一部分凋亡的分子生物学机理部分的内容。 目录 第一节 程序性细胞死亡 第二节 细胞衰老 第一节 程序性细胞死亡 一、 动物细胞的程序性死亡 二、植物细胞与酵母细胞的程序性死亡 一、动物细胞的程序性死亡 （一）细胞凋亡 1．概念：细胞凋亡是一个主动的由基因决定的自动结束生命的过程，所以也常常被称为细胞编程性死亡（programmed cell death,PCD）。 在形态学上细胞凋亡的发生过程可分为3个阶段： 1 .凋亡的起始：细胞表面的特化结构如微绒毛消失，细胞间接触的消失，但细胞膜依然完整；线粒体大体完整，但核糖体逐渐从内质网上脱离，内质网囊腔膨胀，并逐渐与质膜融合；染色质固缩，形成新月形帽状结构等形态，沿着核膜分布。 2. 凋亡小体的形成：核染色质断裂为大小不等的片段，与某些细胞器如线粒体一起聚集，为反折的细胞质膜所包围。细胞表面产生了许多泡状或芽状突起，逐渐形成单个的凋亡小体。3. 凋亡小体逐渐为邻近的细胞吞噬并消化。 2．生物学意义：细胞凋亡对于多细胞生物个体的正常发育，自稳态的维持以及抵御外界各种因素的干扰方面都起着非常关键的作用。例如：蝌蚪尾的消失，骨髓和肠的细胞凋亡，脊椎动物的神经系统的发育，发育过程中手和足的成形过程。 3．细胞凋亡的检测方法 ◆形态学观测：染色法、透射和扫描电镜观察◆DNA电泳：DNA片段呈现出梯状条带◆TUNEL测定法，即DNA断裂的原位末端标记法◆彗星电泳法（comet assay）◆流式细胞分析：根据凋亡细胞DNA断裂和丢失，采用碘化丙锭使DNA产生激发荧光，用流式细胞仪检出凋亡的亚二倍体细胞，同时又能观察细胞的周期状态。 TUNEL（Terminal deoxynucleotidyl Transferase Biotin-dUTP Nick End Labeling） DNA双链酶切→产生 3′-OH末端→脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT） →切口可被标记上生物素-dUTP →加入辣根过氧化酶的链霉亲和素（Streptavidin-HRP） →加底物二氨基联苯胺（DAB），若显示为棕色，即为凋亡细胞。 由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA 的断裂，因而没有3-OH 形成，很少能够被染色。最终通过计数每张切片上不同视野中TUNEL阳性细胞的比例来判断细胞凋亡发生情况。 彗星 诱导细胞凋亡的因子 1)物理性因子：包括射线（紫外线，射线等），较温和的温度刺激（如热激，冷激）等。 2)化学及生物因子：包括活性氧基团和分子，DNA和蛋白质合成的抑制剂，激素，细胞生长因子，肿瘤坏死因子?（TNF?），抗Fas/Apo-1/CD95抗体等。 细胞凋亡的方式分为Caspase依赖性的和 不依赖于Caspase的凋亡 （1）Caspase家族 Caspase属于天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白酶，相当于线虫中的ced-3，这些蛋白酶是引起细胞凋亡的关键酶，一旦被信号途径激活，能选择性地切割细胞内的某些蛋白质，结果是使靶蛋白活化或失活，使细胞不可逆的走向死亡。 哺乳动物细胞Caspase家族共有15种： Caspase-1、4和11负责白介素前体的活化； Caspase-2，-8，-9，-10，-11负责凋亡的起始； Caspase-3，-6，-7是凋亡的执行者。 （2） Caspase依赖性的细胞凋亡 Bcl-2为凋亡抑制基因， Bcl-2表达的蛋白是膜的整合蛋白，其功能相当于线虫中的ced-9。现已发现至少19个同源物，它们在线粒体参与的凋亡途径中起调控作用，能控制线粒体中细胞色素c等凋亡因子的释放。 （3） Caspase非依赖性的细胞凋亡 线粒体向细胞质释放的凋亡相关因子有： AIF（apoptosis inducing factor) 限制性核酸内切酶G（Endo G） （4）生死抉择：细胞凋亡的调