生物物理技术-1研究报告.ppt

2008年诺贝尔化学奖 下村修：于1962年在水母Aequorea victoria发现并分离得到GFP，并发现该蛋白在紫外线下会发出明亮的绿色。 马丁·查尔菲 ：证明了GFP作为多种生物学现象的发光遗传标记的价值，这一技术被广泛运用于生理学和医学等领域。 钱永健：让人们理解了GFP发出荧光的机制。同时拓展出绿色之外的可用于标记的其他颜色，使得同一时刻跟踪多个不同的生物学过程成为现实。 GFP的结构特点 一级结构 GFP由238个氨基酸残基组成，分子量为26.9kD GFP的生色团位于氨基酸序列64~69位 GFP的第65、66、67位氨基酸分别是丝氨酸、脱氢酪氨酸、甘氨酸，为构成GFP生色团的核心 GFP的结构特点 空间结构特点： 由 11 条β桶状结构(β- barrel) 绕成的一个圆柱体，直径约3nm，长约4nm。 一条α螺旋缠绕在圆柱体的轴位置 生色团附着在α螺旋上，几乎完美地包埋于圆柱体中心 这种方式被称为β罐 (β-can) 晶体结构 GFP的发光机理 GFP的生色团是GFP发出荧光的物质基础。 实质：由第65、66、67位的丝氨酸—脱氢酪氨酸—甘氨酸形成对羟苯甲基咪唑环酮 GFP的荧光特性 GFP的最大吸收峰为395nm(紫外)，并有一个479nm的副峰(蓝光)；发射光谱最大峰值为509nm(绿光) 尽管450～490nm(蓝光)是GFP的副吸收峰，但由于长波能量低，细胞忍受能力强，因此更适合于活体检测。 GFP的荧光特性 GFP的光谱特性与荧光素异硫氰酸盐(FITC)很相似，因此为荧光素FITC设计的荧光显微镜滤光片组合同样适用于GFP观察。 GFP荧光极其稳定，在激发光照射下的抗光漂白能力比荧光素强，特别在450～490nm蓝光波长下更稳定。 GFP需要在氧化状态下产生荧光，强还原剂能使GFP转变为非荧光形式，但一旦重新暴露在空气或氧气中，GFP荧光便立即得到恢复。而一些弱还原剂并不影响GFP荧光。中度氧化剂对GFP荧光影响也不大，如生物材料的固定、脱水剂戊二酸或甲醛等。 GFP的荧光特性 通过对GFP的结构和生化特性进行改造，已获得许多具有不同发射峰和激发峰的突变体，使GFP的荧光强度和作为报告基因的检测灵敏度大大提高。 项目 激发峰 发射峰 野生型（wt-GFP） 红移突变体RSGFP 黄绿突变体YGFP 蓝色突变体BFP 增强型突变体OGFP 半衰期短的突变体 395 471-490 513 385 385 488 509 502-511 527 445 510 507 GFP及其主要突变体的荧光特征 nm GFP的优点 易于检测 荧光稳定 无毒害 通用性 易于构建载体 可进行活细胞定时定位观察 易于得到突变体 GFP的应用 蛋白质定位 作为报告基因 药物筛选 融合抗体 生物传感器 其他方面 GFP融合蛋白的构建 目的基因 GFP 基因 融合基因 转化 表达 检测 最关键的就是：要尽可能的不影响目的蛋白的定位和功能。具体蛋白要具体分析。 将目的基因与GFP基因融合有以下几种方式： 将GFP置于目的基因后面，即目的基因-GFP 将GFP置于目的基因前面，即GFP-目的基因。 克隆载体(cloning vector) 为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。 表达载体(expression vector) 为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。 基因工程载体 能够承载外源基因，并将其带入受体细胞得以相对稳定维持的DNA分子称为基因载体。 * 质粒 (plasmid) 人工质粒 GFP标记的微管 细胞器中表达的GFP 植物中表达的GFP 模式动物线虫中的GFP标记 其它荧光蛋白 根据发射光谱，荧光蛋白还有其它类型： BFPs 440–470 nm CFPs 471–500 nm GFPs 501–520 nm YFPs 521–550 nm OFPs 551–575 nm RFPs 576–610 nm FRFPs 611–660 nm 脑虹系统对小脑小叶标记 1、荧光产生的机理是什么？ 2、荧光技术用于研究生物医学样品的主要参数有哪些？量子产率与荧光强度的区别及关系是什么？ 荧光偏振的意义是什么？ 3、举例说明荧光技术的应用？ 4、荧光蛋白 作业： * 四、荧光生色团的结构特点 1、天然荧光生色团的结构特点 （1）碳原子骨架： 分子具有共轭双键体系，大多含有芳香环或杂环 任何有利于提高π电子共轭度的结构改变，都将提高 荧光效率。 例如：对苯基化，间苯基化等。 （2）分子的几何排布： 具有刚性平面结构 荧光素 酚酞 （4）取代基的位置： 邻位、对