现代食品技术研究报告.ppt

Real Time PCR解析方法 3 Real Time PCR解析方法 1. 标准曲线分析 2. 融解曲线分析 3. 绝对定量和相对定量解析方法 实时荧光定量PCR介绍 * * 融解曲线分析 Tm值是指双链DNA分子解链一半时的温度。 SYBR Green I 法进行检出时， 要根据融解曲线确认PCR产物的特异性。 实时荧光定量PCR介绍 * * 特异性产物 非特异产物 引物二聚体 对PCR产物特异性进行分析 融解曲线分析 实时荧光定量PCR介绍 * * 3 Real Time PCR解析方法 1. 标准曲线分析 2. 融解曲线分析 3. 绝对定量和相对定量解析方法 Real Time PCR解析方法 实时荧光定量PCR介绍 * * 绝对定量解析方法 提取样品 引物设计 标准品制备 Real Time PCR反应 数据分析 流 程 实时荧光定量PCR介绍 * * 绝对定量解析方法 通过制作标准曲线来确定样品的初始模板拷贝数或浓度。通常应用于病毒、细菌、衣原体、支原体的定量检测及转基因食品的检测。 105 104 103 101 扩增曲线图 标准曲线图 检测样品 检测样品 102 实时荧光定量PCR介绍 * * 相对定量解析方法 以上条件不可能同时得到满足，必须用内对照基因（管家基因）校正， 进行相对表达量分析。 Sample B Sample A 目的基因扩增效率相同 RNA提取效率相同 细胞起始数相同 进行相对表达量分析必要性 实际上目的基因表达量分析 实时荧光定量PCR介绍 * * 相对定量解析方法 管家基因 维持细胞基本代谢活动所必须的基因, 如：GAPDH、β-actin等。 筛选方法 根据文献提供 通过具体实验筛选 实时荧光定量PCR介绍 * * 主 要 内 容 Real Time PCR基础知识 1 2 Real Time PCR实验方法 3 Real Time PCR解析方法 4 Real Time PCR应用实例 ◇ 对SARS病毒培养液中所含SARS病毒RNA进行定量分析 绝对定量 相对定量 ◇ 分析小鼠某目的基因药物处理不同时间点表达量变化 实时荧光定量PCR介绍 * * 绝对定量应用例 对SARS培养液中所含SARS病毒RNA进行定量 检测方法 TaqMan? probe 法 检测样品 3个从SARS病毒培养液中提取的Total RNA 目的基因 SARS病毒RNA 内 参 SARS Internal Control RNA 标 准 品 SARS Control RNA 试 剂 One Step PrimeScript? RT-PCR Kit （Perfect Real Time）（DRR064） 仪 器 Smart Cycler Ⅱ 实时荧光定量PCR介绍 * * SYN247 F02 SYN247R03 SYN247 F01 SYN247R02 SYN247R01 SYN247 F01 BamH Ⅰ Hind Ⅲ pBluescript II SK(+) Vector T7 Promoter BamH Ⅰ Hind Ⅲ Sac Ⅰ site SARS Control RNA构建 绝对定量应用例 对SARS培养液中所含SARS病毒RNA进行定量 实时荧光定量PCR介绍 * * 纯化的SARS Control RNA OD值测定结果 体外转录的SARS Control RNA 电泳照片 M1 M2 M1: ?-Hind Ⅲ digest M2: DL2,000 Marker DNase I 处理前 DNase I 处理后 绝对定量应用例 对SARS培养液中所含SARS病毒RNA进行定量 实时荧光定量PCR介绍 * * ?DNA BNITMSARAs2 Adaptor R SacⅠsite Bam HⅠsite BNITMSARS1 Adaptor F T7 Promoter SARS Internal Control RNA的构建 A A pBluescriptII SK(+) Vector 绝对定量应用例 对SARS培养液中所含SARS病毒RNA进行定量 实时荧光定量PCR介绍 * * 探针的选择 Template Primer TaqMan? Probe 5’ 端报告基团 3’ 端淬灭基团 SARS Control RNA