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《生化实验技术》综合设计实验方案设计报告 实验项目：鸡卵黄免疫球蛋白（IgY）的分离纯化 专业：生物技术 年级：122 日期：2012.6.11 一、 实验目的： 1 、了解免疫球蛋白分离纯化的基本操作和原理； 2、 学习免疫球蛋白纯度、活性的测定； 3、了解冰乙醇分离的原理和方法； 4、学会各实验仪器的操作方法。 二、 实验原理： 乙醇可以提供自己的羟基或羰基上的氢或氧去形成氢键，从而破坏了蛋白质中原有的氢键，使蛋白质变性。但氢键不是化学键，因此在变化过程中没有化学键的断裂和生成，所以是一个物理变化。 鸡卵黄免疫球蛋白(简称 I g Y )，又称鸡卵黄抗体，是母鸡血液中的免疫球蛋白传递至鸡卵黄并在子鸡孵育过程中和孵育后对予鸡起保护作用的免疫球蛋白。 经大量的研究发现，I g Y 具有不与人类补体[1]以及类风湿因子结合[2]等免疫学特性，现在已被广泛应用于免疫学诊断和医药等许多方面，因而对 I g Y分离纯化的研究有着重要意义。I g Y的分离、纯化丰要包括含有 I g Y的蟹黄水溶性蛋白组分( WSF)的分离和WSF中I g Y的分离。目前，困际上已经开发了多种鸡卵黄抗体分离纯化法，主要包括有机溶剂抽提、盐析与DE A E色谱相结合、疏水色谱及凝胶过滤等。然而，这些方法普遍存在着步骤多、批量小、安全性不岛利回收率低等问题。为此，我们以Horikoshi[3]等人提出的冰乙醇分离纯化法为基础，对冰乙醇分级离心法分离纯化进行了深入的研究，取得了较为理想的结果，分离纯化得剑的l g Y活性比较好。 三、 实验器材： DEAE葡萄糖凝胶A一50(北京百星高科技术货物进出口公司)、Sephadex G200凝胶、 考马斯亮蓝R-250、LG10—2．4A高速离心机(北京医用离心机厂)、721分光光度汁(上海第三分析仪器厂) 四、 材料与试剂（请写明具体配置方法及使用的量）： 市售新鲜鸡蛋或4℃保鲜鸡蛋若干、95％冰乙醇(一20℃，预冷) 、0．028mol／L的NaCl溶液、Tris—HC1缓冲液、SDS—PAGE成套电泳试剂、大肠杆菌(E．coli) (卫生部中国药品生物制品鉴定所) 五、 实验流程（技术路线）： 蛋黄水溶性组分(WSF)的制备 乙醇沉淀纯化IgY 蛋白质回收率的确定及IgY纯度的测定 IgY的活性检测 六、 实验步骤： 6.1 蛋黄水溶性组分(WSF)的制备 选择市售新鲜鸡蛋或于4℃保鲜的鸡蛋，用卵黄分离器去除蛋白，之后将卵黄于滤纸上滚动，吸干，刺破卵黄膜，收集卵黄。以体积百分比计，用一定倍数的蒸馏水稀释卵黄，搅拌10min，使水溶性IgY充分溶出。用HCI调节p H至4.5～5.4 ，稀释液在4℃静置2h，去沉淀。向上清液中加入95％冰乙醇(-20℃)至某一浓度，4℃搅拌20min后离心(22000r／min，4℃，25min)，收集沉淀并向其中加入0．028mol／L的NaCl溶液，4℃条件下过滤除去脂蛋白沉淀，收集滤液得到澄清的水溶性蛋白组分( WSF)。 6.2 乙醇沉淀纯化IgY 取制备好的WSF，向其加入95％冰乙醇(-2 0℃)使其终浓度达到30％(v/v)，也可将最终浓度调至25％(v/v)[4]，离心(22000r／min，4℃，25min)，将沉淀用蒸馏水溶解，并用DEAE葡萄糖凝胶A-50离子交换层析，Tris-HCI缓冲液(含0．15mol／LNaCl)洗脱，然后用Sephadex G200凝胶过滤。 6.3 蛋白质回收率的确定及IgY纯度的测定 蛋白质回收率可采用福林-酚法进行确定[5]。 IgY的纯度则采用十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS)法进行测定[6]。 6.4 IgY的活性检测 以大肠杆菌为试验菌株，进行抑菌实验。将试验菌株分别接种于含有蛋黄抗体和对照组的液体培养基中，在37℃条件下恒温培养，不同时问下从培养物中取样，置于600nm波长下测定各样品的吸光度(OD)值。 七、 结果预测（查阅文献报告可能出现的结果）： 1 随着稀释倍数的增大，蛋白质的含量也逐渐增加，而脂肪含量则逐渐下降。 2 微酸条件下分离效果更好。 3 IgY在大肠杆菌(Ecoli)生长初期有抑制作用，之后抑制作用下降。 参考文献： [1] HoffmanW L，RugglesA0，TabaryaD．J．Immtmo1．Methods，1996，198：67-77 [2]LarssonA，Sjoquist J．J．Immuno1．Methods，1998，108：205—208 [3]Toshio Horikosh T,Hiraoka J ,Sai