中草药多糖实验方案20131121.docx

中草药多糖的提取分离与鉴定分离纯化蛋白质、酶、多糖和核酸。对于生物大分子结构和功能的研究，了解生命活动的规律，阐明生命现象的本质以及指导工业生产、医药实践都有重大的理论和实践意义。糖类物质作为生物大分子具有多种重要的生物功能，参与了生命过程的各种活动。近年来从植物与真菌中分离出的多糖因具有促进免疫功能、抗肿瘤、抗突变、抗病毒、降血糖等功能而日益受到重视，从各种生物材料，尤其是中草药中提取具有一定生物学活性多糖的研究，成为热点研究领域。多糖结构与功能关系的研究是东北师范大学生命科学学院的特色研究方向，为使教学与科研有机地结合，本实验以中草药为材料，分离制备多糖并对多糖含量、多糖组成及多糖分子量分布进行鉴定。生物大分子分离纯化方法很多，主要利用大分子之间分子大小、形状、酸碱性、溶解度、极性、电荷和对其他分子的亲和性等特性的差异进行分离纯化。如盐析、盐溶、有机溶剂沉淀、电泳、超速离心、超滤、离子交换层析、吸附层析、亲和层析、疏水层析和结晶等。生物大分子分离纯化的一般程序为：1. 选材。选择合适的生物材料，并采用与石英砂研磨、超声波振荡、高压挤压、交替冻融法或酶消化法进行预处理。2. 提取。让被提取的生物大分子以溶解状态充分地释放出来，并尽可能保持原来的生物活性。影响提取收率的重要因素主要取决于提取物质在溶剂中溶解度大小、溶剂的理化性质及提取时间。例如，极性物质易溶于极性溶剂，非极性物质易溶于非极性有机溶剂中；碱性生物大分子易溶于酸性溶剂，酸性生物大分子物质易溶于碱性溶剂；温度升高时，溶解度一般相应增大；对于蛋白质、酶等远离其等电点处的 pH 值，溶解度增加；提取时间愈长，溶解度愈大，而同时杂质溶解度也增大。故提取的最佳条件的选择，必须综合分析各种影响因素，合理地搭配各种提取条件。3. 浓缩。当生物大分子提取液获得后，选用一套适当方法，将所要的目的物与其他大分子分离，主要用盐析法、等电点沉淀法、有机溶剂分级分离等。这些方法的特点是简便、处理量大，能除去大量杂质。当提取液很稀，体积又很大，则常用沉淀法（如盐析法、有机溶剂沉淀法等）、减压薄膜浓缩、超滤法及聚乙二醇等吸收剂浓缩法等。4. 提纯。一般样品经粗制分级后，体积较小，杂质大部分己被除去。进一步提纯通常使用柱层析法，包括凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析、疏水层析以及亲和层析等。有时还可选择梯度离心、电泳法，包括区带电泳、等电聚焦等作为最后的提纯步骤。5. 干燥。生物大分子制备得到的产品，为了防止变质、保持生物活性、易于保存和运输，常常要干燥处理，最常用的方法是真空干燥和冷冻干燥。6. 鉴定。在生物大分子分离提纯的过程中，经常需要测定某一大分子的含量和某一大分子的提纯程度。这些分析工作还包括鉴定最后产品的纯度。产品纯度的鉴定通常采用SDS 电泳、等电聚焦电泳、高效液相柱层析、沉降分析等方法。选用任何单独一种鉴定方法都不能确定产品的纯度，必须同时采用2-3种不同的纯度鉴定法才能最终确定。一、中草药多糖的提取[背景与目的]多糖具有较好的耐热性和水溶性，可用热水提取。多糖在70%的乙醇或甲醇溶液中可沉淀析出，故用该浓度的醇溶液分离多糖。学习中草药多糖的提取方法。[仪器与试剂]1．试剂（1）95% 乙醇 （2）无水乙醇乙醚 （4）P2O5（干燥用）（5）NaOH（干燥用）。2．仪器（1）天平 （2）烧杯（3）电磁炉 （4）滤布（5）离心机 （6）真空干燥器[实验方法]1．称取干燥样品30 g，加入300 mL蒸馏水，浸泡过夜。2．煮提90 min，用滤布过滤。向滤渣中加入200 mL蒸馏水，重复提取2次，煮提时间分别为60 min和30 min，合并三次煮提的滤液。3．浓缩滤液至50 mL，冷却至室温。边搅拌边缓缓加入3倍体积的95%乙醇，容器口密封，静置过夜。4．在3000 rpm条件下离心10 min。倾出上清，加适量无水乙醇搅拌使离心管中的沉淀充分分散。5．在3000 rpm条件下离心10 min，去上清，加适量乙醚搅拌使沉淀充分分散。6．在3000 rpm条件下离心10 min，去上清，离心管口用纱布封住，置于盛有P2O5及NaOH的真空干燥器内，真空干燥至少20 h以上。7．称量粗多糖的重量，并计算提取物收率。二、多糖的含量测定[背景与目的]见《生物化学实验指导》，实验26（第85页）[仪器与试剂]1．试剂（1）浓硫酸 （2）无水葡萄糖（3）6%苯酚2．仪器（1）可见分光光度计 （2）容量瓶（3）移液枪 （4）分析天平（5）瓶口分液器 （6）试管[实验方法]1．标准曲线的测定准确称取无水葡萄糖10 mg，加少量蒸馏水溶解后定容至100 mL，得葡萄糖标准液。分别准确量取标准液0（0号管）、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mL于大试管中，补加蒸馏水至1.0 mL。向每只试管中加