卵母细胞成熟过程中添加MG132促进了体细胞核移植之后的胚胎发育且改变了卵母细胞和胚胎的.doc

MG132 Treatment During Oocyte Maturation Improves Embryonic Development After Somatic Cell Nuclear Transfer and Alters Oocyte and Embryo Transcript Abundance in Pigs 卵母细胞成熟过程中添加MG132促进了体细胞核移植之后的胚胎发育且改变了卵母细胞和胚胎的 基因表达水平 摘要 本研究的目的是在卵母细胞体外成熟（IVM）过程中添加一种蛋白酶体抑制剂MG132，检测其对卵母细胞成熟和胚胎发育的影响。在一系列的实验过程中。 来源于中等卵泡（直径3-8mm）的卵母细胞在IVM过程中用MG132处理，分别为0-22小时（M0-22）,30-42小时（M30-42）,以及不添加MG132的对照组（MCO）。结果，在核成熟和胞质成熟上没有显著影响（通过评估细胞内谷胱甘肽和P34cdc2激酶的活性），然而，在孤雌激活（PA）和体细胞核移植(SCNT)后囊胚的形成上，实验组显著高与对照组，具体为：M30-42组PA 为65.2%，SCNT 为27.7%；M0-22组PA45.3%，SCNT 19.5%；MCO组PA 42.6% ，SCNT 13.6%. 基因的表达上，M30-42组IVM 卵母细胞PCNA, ERK2表达增加，而4-cell SCNT胚胎POUF51、 DNMT1、 FGFR2、PCNA表达增加。 来源小型卵泡（直径3mm）的卵母细胞在IVM过程中用MG132处理，分别为0-22小时（S0-22）,30-42小时（S30-42）, 0-22小时MG132处理后再30-42小时IVM（S0–22/30–42）以及不添加MG132的对照组（SCO）。结果，SCNT后在囊胚的形成上，S30-42 为16.5%和S0–22/30–42为 20.8%，高于SCO为8.7%和S0–22为8.8%；在基因表达上，S30-42和S0–22/30–42组，POU5F1、 DNMT1、FGFR2和PCNA都高于SCO和S0–22组。 结论：在猪中，IVM后期阶段用MG132处理卵母细胞，提高了胚胎的发育和改变了基因的表达。 介绍 先进的生殖技术包括体外受精IVF、胞质内精子注射、体细胞核移植SCNT。这些技术使得通过体外生产胚胎来繁殖后代成为一种实际惯例，并广泛应用在很多哺乳动物上。为获得高成功率，体外胚胎生产需要高质量的、成熟的卵母细胞。为了提高卵母细胞的发育能力，在体外成熟系统（IVM）上已经做了很多修改，包括使用生长因子、抗氧化剂(Abeydeera et al., 1998; De Matos and Furnus, 2000; Mito et al., 2009)，和用一些化学药品促进减数分裂的同步化，包括二丁基环单磷酸腺苷环己酰亚胺(Funahashi et al., 1997;Ye et al., 2002).(Susoret al., 2007; Yi et al., 2008)。在卵母细胞成熟过程中用蛋白酶体抑制剂处理能够调节减数分裂，这是通过影响调节蛋白如周期蛋白B1和促蛋白激酶磷酸化来实现(Josefsberg et al., 2000;Huo et al., 2004ab)。一种特殊蛋白酶体抑制剂，MG132，在一定用量、时间条件下，能诱导生发泡破裂和阻滞卵母细胞于M1期(Josefsberg et al., 2000; Chmelikova et al., 2004)。在其他关于猪SCNT的研究中，展示了在重构胚融合或激活后这一时间点，用MG132处理， 结果MG132对SCNT胚胎发育起到了积极影响(Whitworth et al., 2009; You et al., 2010a)。推测：MG132处理，抑制了母源蛋白的降解，而这些母缘蛋白对核重编程和胚胎发育是有益的。 本研究的目的是检测在IVM过成中卵母细胞经MG132处理，对卵母细胞成熟及PA、SCNT后猪的胚胎发育的影响。为此，我们通过检测卵母细胞成熟开始及结束时细胞内谷氨酸含量、成熟促进因子MPF活性和PA或SCNT胚胎分裂率、囊胚率，来评估MG132处理的影响。此外，还检测了IVM卵母细胞、SCNT胚胎的基因表达量，如细胞周期、信号通路、转录、DNA甲基化的相关关键基因(CDK1, ERK2, PCNA, DNMT1, FGFR2, and POU5F1)。我们的结果表明：对猪卵母细胞在IVM后期用MG132处理，增强了卵母细胞胚胎发育的能力，可能原因是通过影响了细胞质的成熟，从而增强了卵母细胞和SCNT胚胎的转录。另外，MG132处理，不仅对中