革兰氏染色技术(底版改动)课稿.ppt

革兰氏染色方法 （一）实验目的 （二）实验原理 （三）实验器材 （四）实验方法 （五）实验作业 （六）注意事项 革兰氏染色法：是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G—）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。该染色法所以能将细菌分为G+菌和G—菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。 G—菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的脂质类，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经番红复染后就成红色。 G+菌细胞壁中肽聚糖层厚含量多且交联度高，脂质类含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。 1、活材料：培养3日的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。 2、染色液和试剂：结晶紫、稀碘液、95%酒精、沙黄（番红）、蒸馏水、二甲苯、香柏油。 3、器材：废液缸、洗瓶、载玻片、接种杯、酒精灯、吸水纸、擦镜纸、显微镜。 （四）操作方法 （1）涂片：取干净载玻片一块，在载玻片中央取一环蒸馏水，按无菌操作法取大肠杆菌涂片，做成浓菌液，注意取菌不要太多。 （2）晾干：让涂片自然晾干或者在酒精灯火焰上方文火烘干。 （3）固定：手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜）。 （4）结晶紫初染：将玻片置于废液缸玻片搁架上，滴加适量（盖满细菌涂面）的结晶紫染色液染色30秒；水洗：倾去染色液，用水小心地冲洗。 （5）媒染：滴加稀碘液，媒染30秒；水洗：用水洗去稀碘液。 （6）脱色：将玻片倾斜，连续滴加95%乙醇脱色30秒至流出液无色，立即水洗。 （7）复染：滴加沙黄复染30秒；水洗：用水洗去涂片上的沙黄染色液。 （8）晾干：将染好的涂片用吸水纸吸干。 （9）镜检：镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油镜观察，并判断菌体的革兰氏染色反应性。 ①将浸过油的镜头按下述方法擦拭干净， a.先用擦镜纸将油镜头上的油擦去。 b.用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头擦2-3次。 c.再用干净的擦镜纸将镜头擦2-3次。注意擦镜头时向同一个方向轻轻擦拭。将显微镜小心轻拿，按号放入显微镜柜中。 ②观察后的染色玻片用废纸将香柏油擦干净，放入回收容器内。 1.革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。脱色时间的长短还受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响，难以严格规定。 2.染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应吸去玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。 3.选用幼龄的细菌。G+菌培养3日内，E.coli培养5日内。若菌龄太老，由于菌体死亡常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。 绘出金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的形态图，并注明两菌的革兰氏染色的反应性。 * * 几 （一）实验目的： 学习细菌革兰氏染色法。 （二）实验原理 1 2 3 4 ？ 结晶紫 碘液 酒精 复红 革兰氏阴性杆菌 革兰氏阳性杆菌 G+球菌与G-杆菌 （三）实验器材 （10)实验结束后的处理 ？ （五）注意事项 （六）实验作业 * 几 * *