615干细胞中课稿.ppt

干细胞培养条件 高糖DMEM培养基、高质量的胎牛血清、谷氨酰胺、丙酮酸钠、非必须氨基酸、明胶、β-巯基乙醇。 用人或胚鼠的成纤维细胞作为饲养层细胞。经X光或丝裂霉素抑制分裂 加入LIF来抑制干细胞的分化。 饲养层细胞  feeder layer cells 抑制胚胎干细胞分化，维持干细胞增殖能力。 分泌白血病抑制因子（LIF）等细胞分化抑制因子，及多种促有丝分裂因子。 LIF在维持ES增殖和维持未分化状态中起着最重要的作用。 应用饲养层细胞层的意义 饲养层细胞能够抑制胚胎干细胞分化，维持胚胎干细胞全能性与增殖能力。 饲养层细胞可分泌白血病抑制因子等细胞分化抑制因子，及多种促有丝分裂因子。是干细胞体外培养扩增的一个关键环节。 LIF在维持胚胎干细胞未分化状态过程中起着最重要的作用。 白血病抑制因子（LIF）leukemia inhibitory factor, LIF 由Tomida于1984年发现体内存在一种对小鼠骨髓样白血病细胞具有抑制作用的细胞因子，后来因此得名。 LIF可诱导白血病细胞向巨噬细胞分化，这只是其极多种生物学功能之一。 LIF在生殖过程中起重要作用，LIF是介导胚泡着床最主要的细胞因子。 1981年Martin Evans等许多学者发现维持小鼠胚胎干细胞的未分化状态，必须引入饲养层细胞。大量研究最终确认，抑制ES分化的物质就是LIF。 白血病抑制因子leukemia inhibitory factor,LIF LIF可促进胚胎干细胞的我更新和抑制干细胞的分化，以维持胚胎干细胞的全能性。 培养过程中LIF和饲养层细胞一旦被撤除，胚胎干细胞会分化为类胚体，或迅速分化成各种组织细胞。 人工诱导后可定向分化为多种类型的细胞。 胚胎干细胞集落及饲养层细胞 鼠源性饲养层细胞Mouse feeder cells 小鼠胚胎成纤维细胞是培养胚胎干细胞最常用的饲养层细胞。 STO细胞是永生化的小鼠成纤维细胞株。应避免长期传代产生的细胞变异，导致分泌细胞因子的能力下降。 鼠源性饲养层细胞的抗原性 用小鼠细胞作为人ES饲养层，使人ES常带有鼠源性Neu5Gc抗原，而多数人体内都含有该抗原的抗体，干细胞植人体后易影响移植细胞的存活率。 有必要开发人原性饲养层细胞。 人源性饲养层细胞Human feeder cells 用人胚肌细胞、表皮细胞、胎盘成纤维或间充质干细胞作为饲养层细胞。 将人ES细胞定向分化为饲养层细胞，能够更好地避免异源污染。 导入表达人端粒酶基因，使细胞永生化，能更好地维持人ES生长。 人饲养层细胞和人胚胎干细胞间的复杂作用会使hES细胞增殖和分化机制变得更为复杂。 无饲养层培养体系 利用各种能分泌上述因子的饲养层细胞培养上清制备条件培养基，但与饲养层培养体系无本质差别。 在基础培养基中定量加入促进干细胞增殖和抑制分化的细胞因子，制备成专用条件培养基，使得培养及分化条件易于控制，但成本更高。 培养中的拟胚体embryoid body 治疗性克隆therapeutic cloning 体细胞核植入去核卵母细胞中，使其发将育成囊胚,从中分离胚胎干细胞，使之定向分化为患者所需的细胞类型。 比从胚胎中分离细胞简单，成功率高。 患者自体核移植可避免免疫排斥。 将ES分化成卵母细胞可扩大细胞来源。 治疗性克隆减少伦理道德方面的争论。 治疗性克隆已获得多个国家的允许。 核移植中的供体与受体细胞 供体细胞：胚胎细胞（卵裂球）、胚胎干细胞（内细胞团）、体细胞（核） 受体细胞：MⅡ期（次级）卵母细胞、合子期受精卵、2细胞期胚胎。 MⅡ期细胞核移植成功率最高，可通过超排法获得，也可经体外培养成熟。 去核前可将卵母细胞先进行荧光染色，以便观察。 卵母细胞的去核 吸核法：细胞置于含有细胞松弛素的培养液中，破坏细胞骨架，增加膜流动性，去核后细胞膜仍保持完整。用去核针穿过透明带，将染色体吸出。 化学诱导去核法：秋水仙胺(抑制纺锤体微管装配)能使MⅡ中期染色体无法分离而全部随第二极体排出。 重组胚的构建 电融合法：去核的卵母细胞与供体细胞体积差别很大，融合条件比较苛刻。 胞质内注核法：直接将细胞和注入卵母细胞，最好用压电高频注射系统，否则对细胞伤害较大，对技术要求高。 透明带下注核法：将细胞核注入到卵细胞透明带下，再经电融合法融合。 重组胚的激活 由于缺乏受精瞬间引起的钙震荡刺激，移植核后的卵母细胞仍处于失活状态，融合时的电脉冲也不足以激活重组胚，必须采用其它的方法激活。 电激活：高压直流脉冲使细胞出现微孔，钙离子以震荡形式激活卵母细胞。 乙醇激活：诱发细胞器释放钙离子，有些物种不敏感，有些甚至可以发育到囊胚。与相关药物合用效果更好。 铯离子激活：可稳定诱导内源钙释放。 干细胞的鉴定方法 细胞形态与结构