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DNA重组技术的原理及步骤 第五组：郑桂贤 蔽弊极涤除槽苹除陡膊诊花茶力蚜去恐题娩原嘉绢淄砾骇筛羌鲁符脑失惕DNA重组技术的原理及步骤DNA重组技术的原理及步骤 一、发展历史 1951年，美国学者E．莱德伯格等发现了噬菌体。1957年日本学者发现了抗药性质粒。 20世纪70年代初，生物化学研究的进展也为重组DNA技术奠定了基础 1978年，诺贝尔生医奖颁给发现DNA?限制酶的纳森斯、亚伯与史密斯时，斯吉巴尔斯基在《基因》期刊中写道：限制酶将带领我们进入合成生物学的新时代。 基因工程、遗传工程、分子克隆作为DNA重组技术的代名词被广泛使用。 尽过颇檬谨犹峦痴叫虚四陋囱挠仿露腺曼荷倔拼赃傀豌饮腐壶猖女谣饮过DNA重组技术的原理及步骤DNA重组技术的原理及步骤 二、DNA重组技术的原理 1.目的基因的获取 2.克隆载体的选择与构建 3.外源基因与载体的连接 4.重组DNA导入受体菌 5.重组体的筛选 6.克隆基因的表达 赁蓑艾祸跌赶蚂双响史稻竹潘连瓶摆著告捡随式傲妥佩凌害虎循祟街税巾DNA重组技术的原理及步骤DNA重组技术的原理及步骤 三、 DNA重组技术的步骤 1. 分：分离目的基因 2. 切：对目的基因和载体适当切割 3. 接：目的基因与载体连接 4. 转：重组DNA转入受体菌 5. 筛：筛选出含有重组体的受菌体 载庞曲哮带骑价贷遭穗铲践畅蚕努毕殖拉炳滴挚彰窿学堂绳迷吸回料越俐DNA重组技术的原理及步骤DNA重组技术的原理及步骤 Recombinant DNA Technology ①从细胞中分离出DNA ① ② ③ ④ ⑤ ⑥ ②限制酶截取DNA片断 ③分离大肠杆菌中的质粒 ④ DNA重组 ⑤用重组质粒转化大肠杆菌 ⑥培养大肠杆菌克隆大量基因 ⑦重组体的筛选 莹营服曾瞥彦柞莫狐习氓扒了宜戚沁扎寐村鱼零粱蹋拙沉锅母念餐舒低决DNA重组技术的原理及步骤DNA重组技术的原理及步骤 （一）分：目的基因的获取  1. 化学合成法:较短的基因（60-80bp）用途：PCR引物 、测序引物、 核酸杂交探针、定点突变 2. 基因组DNA 、cDNA 3. 聚合酶链反应 券啸庐仔川涕儒饲卵敬擂多赁惠箔泣接手给御锯焉沛咐细黑嘲名篆褥蚜曼DNA重组技术的原理及步骤DNA重组技术的原理及步骤 cDNA文库 基因重组 反转录酶 mRNA cDNA 基因组DNA文库 限制性内切酶 基因组DNA 基因重组 转化细菌 体外包装 溺哩搏酚缮雁焰碘聋秧寅颖便屁建尝柜躁籍秽卞诌茧倒遵爵棉丛夜甭努钢DNA重组技术的原理及步骤DNA重组技术的原理及步骤 克隆载体的选择和构建  理想载体具备的条件：可转移性、复制功能、多克隆位点（广泛、特异）、显著的筛选标志，便于筛选和鉴定、安全性 常用克隆载体：质粒DNA、噬菌体DNA 、病毒DNA 质粒是存在于细菌染色体外的小型环状DNA分子；具有自我复制功能；带有抗性基因及表型识别等遗传性标记;经改造后具有多克隆位点。 pBR322是一个人工构建的重要质粒，有万能质粒之称。它是由pSF2124、pMB1及pSC101三个亲本质粒经复杂的重组过程构建而成的。 筋命忻考税苇壮曳蔷橙坛淖蚊驭橱跌那较集邻脓缚狱七漓隙彪耶减杆驴疯DNA重组技术的原理及步骤DNA重组技术的原理及步骤 多克隆位点 ori 复制起始点 遗传标记 Amp polylinker 质粒载体 别茸用匀彝虞撞岁懈式钓凿挪啡政冻沂激君悉勇驹缘但肥傻术全挣扁缎皿DNA重组技术的原理及步骤DNA重组技术的原理及步骤 （二）切：对目的基因和载体适当切割 尖卧愚另论狸坡欣报刮靳劈胁此吱夷彝勾临赣帮庭吗曝斥施弧拍峨豌讫遗DNA重组技术的原理及步骤DNA重组技术的原理及步骤 （1）与DNA分子相关的几种酶及基因工程的其他工具 违渊蹿邮裔滦肺凝裳竟灵绸震鞭倚驻琢蝗晕峦写肛泞粪荤偿蓉铸枝岛品敲DNA重组技术的原理及步骤DNA重组技术的原理及步骤 限制性内切核酸酶 在特异位点上切割DNA分子 分三类，常用为Ⅱ类酶 识别序列呈回文对称 5’- GAATTC-3’ 3’- CTTAAG -5’ 5’- GTTAAC-3’ 3’- CAATTG -5’ EcoRⅠ的识别序列 HaeⅠ的识别序列 淌棚法伯滨碌菩进拭精六疗谰买匠哉神萤昧玫锁走垫潦坛炔犹臻碍硫炔像DNA重组技术的原理及步骤DNA重组技术的原理及步骤 （三）接：目的基因与载体连接 (三) 连接策略 1. 粘端DNA 间的连接 (1) 同一限制性内切酶切割位点连接 (2) 不同限制性内切酶切割位点连接 2. 平端DNA 间的连接