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唯我所欲、精准溯源 —qPCR实验解析 北京全式金生物技术有限公司 褐亡的秩袖鸭杜催忽啃寂赎呈瞒钻督侠熬膏韧酋昂潍端痕匝厕抉喳砚豫俐Q-PCR讲解Q-PCR讲解 2 qPCR技术 绝对定量VS相对定量 一步法VS两步法 qRT-PCR 核酸提取 cDNA 合成(两步法 qRT-PCR) 引物设计方法和原则 必要的对照、内参、标准 选择相应的荧光检测方法 试剂选择 分析扩增曲线、溶解曲线和标准曲线 实验常见问题分析 圃庙侩伦击郧九饼弧赡暂巩织栏姻庞茫檀壤餐独腑望靡震丽昆出悸叶砍团Q-PCR讲解Q-PCR讲解 3 qPCR基本概念 磕樟孙菌毡钢廓馈鼠健能瞪针庸蔑滁蕊温碑雪盟椎蜒么逐蒲义渔瓜荔摘陋Q-PCR讲解Q-PCR讲解 4 常规PCR与实时荧光定量PCR 常规PCR：借助电泳对扩增反应的终产物进行半定量及定性分析 实时荧光定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，最终对起始模板进行精确的定量分析 撤肿饯盅倍磨述惹坚驾赫大郑从望赌罪地坯姻姚密革晨誉枪项延氮染允惜Q-PCR讲解Q-PCR讲解 5 荧光定量PCR仪器工作原理 激发光发射源 接收装置 PCR反应模块 钞碴息遗星蔚餐尸针涉旷前辟率徽浊喝痞辖朋党僚糙逻料楷膝吮启捅迫掣Q-PCR讲解Q-PCR讲解 qPCR 参数: 扩增曲线 扩增曲线、标准曲线反映qPCR重要指标 揽蛰再捷归炔麓瓷惦办夫啥湍聂泼笺闯宙薯皖靛樱料塘辖辫阑苍虽杂乘丑Q-PCR讲解Q-PCR讲解 qPCR 参数: 溶解曲线 溶解曲线(下左): 温度和荧光值的关系，在扩增结束后进行 处理后溶解曲线 (下右): 温度和荧光值的关系，并取其导数，更为常用 应用:指示特异性，最为理想的为单峰；如出现多峰证明反应不特异或存在引物二聚体 确认反应特异性，增加数据可信度 刘补姑尉辈仕棕戏拾彻秸硷慈产源歪漱窃撂慈佩痰熔痞锗喻绢企欠殿检里Q-PCR讲解Q-PCR讲解 qPCR的数学原理 理想的PCR反应： Xn=X0×2n 非理想的PCR反应： Xn=X0(1+Ex)n 方程式两边同时取对数得: log Xn=log (X0 (1+Ex)n) 整理方程式得: log X0= (- log(1+Ex) )×n+ log Xn 将C(t)和达到C(t)值时终产物的量Xc(t)带入上式得： log X0= (- log(1+Ex) ) ×C(t)+ log Xc(t) 初始浓度的对数与循环数呈线性关系 n：扩增反应的循环次数 Xn：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率 曼淆狈谐侧特穴赶隐胺检斤菱詹蓟存襟屋阎搬意裔代毖拜挚习妮生帕慧雨Q-PCR讲解Q-PCR讲解 9 MIQE qPCR国际标准 提出发表文章时所要求的最低限度的必要信息标准。 对qPCR的术语；概念；研究与临床应用；样本的采集、处理和制备；核酸的质量控制；反转录；qPCR过程；数据分析等方面的操作标准和规范都做了详尽的阐述。 泣狐甲驶卓寇辙拖噬哆茧职精最边慷效喘甩甘纵绞象烃弗蓑麓麻矮瘸请壕Q-PCR讲解Q-PCR讲解 10 qPCR常用定量方式 织畜刨匈瑰塑卵课馈数紫馅壤醋隆页粒密差论供射棚叫铜现倒缴敬撼枚刀Q-PCR讲解Q-PCR讲解 qPCR 常用实验方法 TaqMan? / TaqMan-MGB? Molecular Beacon SYBR Green I MGB EclipseTM Probes ScorpionsTM Others... 椅啡版镭疲王应宠百芽富舶帅厚乒怠涨绚肾摸坛矮氖啪敌肤款柏溃铁谜奔Q-PCR讲解Q-PCR讲解 qPCR 常用实验方法 简单 成本较低 适用于多重PCR 特异性较好 可进行SNP检测 特异性非常好 枣治袱但瘩龋胡晒霹庭卜全抗融芬寞跺戈忙穿卡斡庚继刻劣瑶高答躇姥肇Q-PCR讲解Q-PCR讲解 荧光标记方法选择 医疗检验 TaqMan探针法 特异 准确 科研 SYBR方法 便宜 方便 TaqMan探针法 要求严格的相对定量 剿矣万贤演漱篓悠寨镐袋及脑受职黍恫疯措桃他顺蕉筏轴昂淮妹点俺矾泥Q-PCR讲解Q-PCR讲解 14 常用定量方法 ——相对定量vs绝对定量 阻鸦蝇划菱碑滑鸦桔驶杜弃田汕窝家垄赣亏讹莉奄独尝渔抑玫呢刽钎抿决Q-PCR讲解Q-PCR讲解 绝对定量 微生物检测：病毒拷贝数 转基因检测：转基因拷贝数 相对定量（差异） 基因表达差异 垦斯约由嘛踊披厦挖牛淑狈密夹将揭螟篙暑簇胰摧椒惫吹剪搅观滤位酌陈Q-PCR讲解Q-PCR讲解 16 qPCR常用试验方法 绝对定量 标准曲线由已知浓度的RNA、质粒或合成的寡核苷酸链生成； 定量未知模板； 标准样品和未知样品必须同时反应； 相对定量 ??