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树突状细胞体外刺激对HBV特异性细胞毒T细胞影响的研究
树突状细胞体外刺激对HBV特异性细胞毒T细胞影响的研究 张恒辉 何豫 赵鸿 朴文花 刘茂昌 席宏丽于敏 王贵强 北京大学第一医院感染疾病科 研究背景 研究背景(1) 研究背景(1) 关于恢复DC功能的研究 研究目的 本研究通过在体外进行慢性乙型肝炎患者单核细胞的DC方向转化,并辅以聚肌胞Poly(I:C)刺激,增强DC的成熟和功能。 将患者DC经HBV core18-27肽负载后,刺激病人自身的T淋巴细胞。并用Elispot法及本研究室构建的HLA-A2肽四聚体复合物检测病毒特异性T淋巴细胞的数量和功能。 研究对象和方法 研究对象 22例HLA-A2+慢性乙型肝炎患者。 HBeAg+患者16例、 HBeAb+患者6例。HBV DNA 均≥104 copy/ml。 排除HCV、HAV、HDV、HEV感染。近半年没有接受过抗病毒治疗。 研究方法 HLA-A2型别鉴定 DC的体外培养扩增及鉴定 以树突状细胞为抗原递呈细胞体外诱导病毒抗原特异性T细胞 Elispot检测分泌IFN-γ的T细胞频数 MHC-肽四聚体检测 HBVcore18-27 肽特异性CD8 + T 细胞 HLA-A*02型别鉴定 外周血淋巴细胞标记鼠抗人HLA-A02单抗; 流式细胞仪检测; 每份标本均设自身阴性对照。 树突状细胞的体外培养扩增及鉴定 分离病人PBMC; GM-CSF、IL-4 刺激下DC培养转化; Poly(?I:C)刺激; 通过流式细胞仪检测DC的HLA-DR、CD80、CD86、CD83、CD14等表面分子表达,进行功能及成熟度的鉴定。 以DC为抗原递呈细胞体外诱导HBV抗原特异性T细胞 培养成熟DC负载HBV 核心肽(HBV core18-27 FLPSDFFPSV); DC与自体T细胞共培养48-72h; 单纯IL-2维持未经自身树突状细胞刺激T细胞组为对照。 Elispot检测分泌IFN-γ的T细胞频数 封闭 种板 孵育:37℃,5% CO2 孵育15-20 h; 显色 计数:CTL IMMUNOSPOT分析仪计数,取两复孔的平均值 MHC-肽四聚体检测 HBVcore18-27 肽特异性CD8 + T 细胞 PE-HLA-A0201/HBVcore 18-27 tetramer 和FITC-鼠抗人CD8标记; 流式细胞仪检测; 慢性乙型肝炎患者,采用HLA-0201/HCV 四聚体标记作为阴性对照; 统计学处理 实验数据以?x±SD表示。用SPSS10.0软件进行统计分析,组间比较用配伍组方差分析。 结 果 DC的扩增、表型鉴定及Poly (I:C)对其表面分子表达的影响 Poly(I:C)对DC表面分子表达的影响 经Poly(I:C)刺激后: CD80、CD83表达明显上调。 CD14的表达明显下降 。 Elispot检测HBV特异性的分泌IFN-γ 的CTL细胞频数的比较 Elispot检测结果说明 病人T细胞在经自体树突状细胞刺激后与未刺激前相比,分泌IFN-γ 的CTL细胞频数均值由16上升为46,约为2.9倍; 发现经Poly(I:C)作用后的树突状细胞所活化的特异性分泌IFN-γ的T细胞频数明显升高,均值为98,和未经树突状细胞刺激组和树突状细胞刺激组相较,分别升高6.1和2.1倍。 Tetramer 结果说明 患者T细胞在经自体树突状细胞刺激后与未刺激前相比, HBV core18-27 肽特异的CTL频数均值由0.77 %上升至1.92%,提高约2.5倍,差异均有统计学意义( P <0.001)。 经Poly(I:C)刺激的树突状细胞活化后,HBVcore18-27 表位特异性CTL的频数均值上升为3.49 %,分别为前2组的4.5和1.8倍,差异均有统计学意义(P值均小于0.001)。 讨 论 讨论(1) 树突状细胞能激活幼稚T细胞,调节T、B淋巴细胞的功能;在病毒抗原摄取、递呈及特异性激活抗病毒免疫反应中发挥重要的作用,是抗感染免疫的中心环节。 HBV急性感染时:多克隆、高反应性的病毒特异性CTL——可迅速、彻底清除病毒; HBV慢性感染时:单一克隆、弱反应性的病毒特异性CTL。 讨论(2) 聚肌胞Poly(I:C)是一种Ⅰ型和Ⅱ型干扰素的强诱生剂。 Poly(I:C)能够有效地诱导体外单核细胞转化的树突状细胞成熟,并维持树突状细胞的成熟状态 。 CD83:DC成熟;行使功能 CD83表达 DC成熟及功能改善 CD14:单核细胞的特异性分子标记 CD14表达 DC分化程度改善 讨论(3) MHC-肽四聚体染色
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