流式细胞凋亡分析.ppt

流式细胞分析细胞凋亡 细胞对染料吸收能力的检测 赫斯特类染料（特别是HO33342)检测细胞凋亡的原理与上述染料不同。HO33342是双苯并咪唑家族成员之一，能特异与DNA螺旋中富含A-T重复序列结合。HO33342用氪激光激发紫外线荧光，激发光波长为352nm，发射光波长为400-500nm，产生蓝色荧光。 流式细胞分析细胞凋亡 细胞对染料吸收能力的检测 HO33342能被活细胞摄取，而其从细胞内排出是一个耗能的主动过程，依赖细胞膜上的P-糖蛋白泵。活细胞染色时，应考虑是否存在细胞抗药性问题，如有耐药性，则染色效果不佳。HO33342进入凋亡细胞比正常细胞多，将其与PI结合对凋亡细胞进行双染，可将正常细胞、凋亡细胞和坏死细胞区分开来。 流式细胞分析细胞凋亡 细胞对染料吸收能力的检测 在双变量流式细胞仪的散点图上，这三群细胞表现为：正常细胞低蓝光/低红光，凋亡细胞为高蓝光/低红光，坏死细胞为低蓝光/高红光。 流式细胞分析细胞凋亡 caspase的流式细胞仪检测 caspase家族在细胞凋亡过程中起着重要作用，通过caspase对大分子结构的瀑布级联水解反应，导致凋亡发生。其中caspase-3是最重要的指示蛋白酶，活化的caspase-3可以蛋白水解切割和激活其他的caspase、相关胞质的靶位点（CK18）等。Caspase-3切割细胞因子，尤其是CK18，是凋亡过程中caspase切割发生的早期指示因子。 流式细胞分析细胞凋亡 流式细胞分析细胞凋亡 caspase的流式细胞仪检测 caspase-3的活性在细胞凋亡发生前是检测不到的，只有在凋亡早期才能检测到。随后在凋亡的过程中持续升高，在凋亡晚期快速下降。因此，对caspase-3的连续检测可动态观察凋亡的整个过程。 流式细胞分析细胞凋亡 线粒体功能的检测 线粒体被认为是凋亡生化反应的基地，因为它可能是决定细胞存活或死亡的中心。线粒体的一个重要作用是在外膜形成通透性通道孔（线粒体大通道），允许线粒体内的蛋白流入胞质。线粒体大通道的开放，导致质子在内膜两侧的不对称分布被破坏，即线粒体跨膜电位（TMP）被转变。 流式细胞分析细胞凋亡 线粒体功能的检测 TMP的变化是凋亡早期特有的现象。TMP由膜内外包括质子在内的离子形成的。内膜内面带负电，因此带正电的亲脂性荧光素会集中分布于线粒体基质。凋亡早期TMP的变化导致其聚集荧光色素的能力丧失。其发生要早于DNA断裂和PS外翻。 流式细胞分析细胞凋亡 线粒体功能的检测 TMP的变化可通过适于流式细胞仪检测的荧光染料来检测。多种膜通透性亲脂阳离子荧光色素，如罗丹明123（RH123）被用于流式细胞仪检测TMP的探针。当它们与活细胞一起培养时，探针被聚集于线粒体，通过测定细胞荧光色素的强度及外流来反映TMP的变化。 流式细胞分析细胞凋亡 线粒体功能的检测 位于线粒体的启动凋亡和抑制凋亡的bcl-2/bax家族蛋白通过形成同源性或异源性二聚体在线粒体跨膜电位的调控中起重要作用。所有bcl-2家族蛋白都可通过特异性抗体进行FCM测定。 流式细胞分析细胞凋亡 线粒体功能的检测 线粒体在凋亡时的变化及与bcl-2家族蛋白之间的相互作用发生于凋亡早期，影响细胞对凋亡的敏感性。bcl-2家族蛋白可能影响抗肿瘤治疗的转归。因此，流式细胞仪检测这些变化，在肿瘤学上具有一定意义。 流式细胞分析细胞凋亡 细胞内Ca2+的检测 细胞发生凋亡时，其胞质内Ca2+浓度升高，pH调节能力丧失，导致细胞磷酸化。目前有许多检测细胞内Ca2+浓度的方法，但通过流式细胞仪采用Ca2+选择性的荧光探针（Flu-3）检测细胞内Ca2+浓度仍是最佳方法。 流式细胞分析细胞凋亡 细胞DNA含量的检测 使用PI荧光染料通过流式细胞仪进行细胞DNA含量测定，会出现一亚二倍体细胞峰（sub-population),为DNA低染色的细胞群，其峰值低于正常G0/G1区域。DNA染色能力降低主要是由于内源性核酸内切酶激活及低分子量DNA流失。 细胞凋亡的基因调控 常见的凋亡基因及其蛋白： 3 Fas和Fas配体 Fas是肿瘤坏死因子（TNF）受体和神经生长因子受体家族的细胞表面分子。Fas配体（Fas ligand,FasL)是TNF家族的细胞表面分子。FasL与其受体Fas结合导致携带Fas的细胞凋亡。抗Fas抗体、表达FasL的细胞和可溶性的FasL与Fas交联均产生细胞凋亡信息，而bcl-2过度表达能抑制Fas致凋亡作用。 细胞凋亡与疾病 细胞凋亡与肿瘤： 以往，细胞增殖的失调、细胞分化与增殖紊乱被认为是恶性肿瘤的发生机制。近来，人们认识到在肿瘤细胞快速增殖过程中，同时也发生凋亡，增