生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制.pptVIP

微生物特异性平板检测方法 阶梯性筛选法 梯度平板法 纸片扩散法 用打孔器将较厚的滤纸（如新华六号）打成小圆片，并使纸片吸收一定浓度的药物，经干燥或不经干燥，放入涂布了菌悬液的平板上，一般9厘米的培养皿中等距放置三片为宜。经培养后观察围绕纸片的抑菌圈，抑菌圈内出现的可能就是抗性菌。 组成酶变异株的筛选 诱导酶的生产需要诱导物，而且受到诱导物的种类、数量以及分解产物的影响。能迅速利用的碳源（如葡萄糖）会引起酶合成的减少，诱导物有时又比较昂贵。 生产成本提高 控制酶合成的调节基因发生了变异 诱导酶转变成组成型酶 具体的筛选方法有恒化器法、循环培养法和诱导抑制物法 恒化器法：恒化器常被用于微生物的“驯化”，添加不能起诱导作用的低浓度底物，缓慢生长 循环培养法：利用不含诱导物的培养环境和含有诱导物的培养环境进行交替循环培养待分离的菌悬液，从而使组成酶变异株得到富集。 诱导抑制剂法：加入诱导抑制剂如α-硝基苯基-β-岩藻糖苷阻止某些诱导酶的合成 4.3 体内基因重组育种 接合、转化、转导和原生质体融合等遗传学方法和技术使微生物细胞内发生基因重组 4.3.1.原生质体融合 将遗传性状不同的两种菌(包括种间、种内及属间)融合为一个新细胞的技术。 选择亲株、原生质体的制备、原生质体的融合、原生质体再生和融合子选择等步骤 步骤 微生物原生质体融合的一般原理和过程 选择亲株 选择遗传性状稳定且具有优势互补的两个亲株 为了能明确检测到融合子，参与融合的亲株一般都需要带有可以识别的遗传标记，如营养缺陷型或抗药性等 原生质体制备 去除细胞壁是制备原生质体的关键 革兰氏阳性菌的细胞壁主要由肽聚糖组成 溶菌酶 微球菌、枯草杆菌、巨大芽孢杆菌、黄色八叠球菌 革兰氏阴性菌不能直接溶壁，只有当乙二胺四乙酸（EDTA）存在时，某些革兰氏阴性菌的细胞壁才能够被溶菌酶溶解。 金黄色葡萄球菌 溶菌酶不能溶解 表皮葡萄球菌能产生一种内肽酶——葡萄球菌素，溶解 放线菌的细胞壁结构类似于革兰氏阳性菌也可采用溶菌酶 真菌细胞壁主要由纤维素、几丁质和葡聚糖等组成 青霉菌多用纤维素酶和?-1,3-糖苷酶等溶壁 曲霉用?-1,3-糖苷酶和?-1,4-糖苷酶等 酵母菌细胞壁中的葡聚糖和几丁质 蜗牛酶 培养基中添加甘氨酸，可以使菌体较容易被酶解 在菌体生长阶段添加蔗糖也能提高细胞壁对溶菌酶的敏感性 在菌体生长对数期加入适量青霉素，就能使细胞对溶菌酶更敏感 菌龄：对数生长中期细胞的细胞壁中肽聚糖含量很低，对溶菌酶敏感。 原生质体制备的其他因素： 一般是将原生质体放在高渗的环境中以维持它的稳定性 原生质体融合 聚乙二醇（PEG）能有效地促进原生质体融合 一般PEG的使用浓度范围在25-40% 采用电融合仪：在高频电场下，用直流电穿孔来进行融合 原生质体再生 使原生质体重新长出细胞壁 ，恢复完整的细胞形态结构 * 生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制 不会有代谢产物的积累 解除或突破微生物的代谢调节控制 目的产物积累 微生物育种的目的 方法：突变、体内重组 体外重组（基因工程） 4、工业微生物育种 4.1从自然界中获得新菌种 微生物资源分布 土壤、水、空气、动植物及其腐败残骸都是微生物的主要栖居和生长繁殖场所 分离微生物新种的步骤 采样、增殖、纯化和性能测定等步骤。 典型的微生物采样和筛选方法 直接从自然界分离得到的菌株为野生型菌株。往往低产甚至不产所需的产物，只有经过进一步的人工改造才能真正用于工业生产 菌种选育 突变、体内重组 体外重组（基因工程） 4.2 诱变育种 化学诱变 物理诱变 紫外线 5-溴尿密啶 4.2.1 紫外线诱变 造成DNA链的断裂，或使DNA分子内或分子之间发生交联反应 机理 交联是由二聚体引起的，二聚体可以在同一条链相邻的碱基之间产生，也可以是在二条链的碱基之间形成。 研究的比较清楚 引起DNA复制错误 嘧啶比嘌呤对紫外线敏感得多 胸腺嘧啶二聚体 嘧啶的紫外线光化产物 诱变过程中需要注意 光复活作用 微生物等生物的细胞内存在光复活酶 光复活酶识别胸腺嘧啶二聚体，并与之结合形成复合物 打开二聚体，将DNA复原。 可见光光能（300-500nm）激活光复活酶 此时的光复活酶没有活性 PRE为光复活酶 暗修复 细胞内还存在另一种修复体系，它不需要光激活 可修复由紫外线、γ射线和烷化剂等对DNA造成的损伤。 暗修复体系有四种酶参与反应。 核酸内切酶切开二聚体的5’末端,形成3’-OH和5’-P的单链缺口 核酸外切酶从5’-P到3’-OH方向切除二聚体，并扩大缺口 DNA聚合酶以另一条互补链为模板，从原有链上暴露的3’