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Ligase chain reaction (LCR) 东胜创新 东胜创新生物科技有限公司 PCR技术讲座（二） 常规PCR技术及几类PCR新技术的 介绍 热启动PCR Touch-down PCR RT-PCR 兼并引物PCR 巢氏PCR 反向PCR 不对称PCR 原位PCR 连接酶链反应 RACE-PCR AFLP 免疫-PCR(immuno-PCR) MSP甲基化特异PCR 热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性最重要的方法之一。尽管Taq DNA聚合酶的最佳延伸温度在72℃，聚合酶在室温仍然有活性。因此，在进行PCR反应配制过程中，以及在热循环刚开始，保温温度低于退火温度时会产生非特异性的产物。这些非特异性产物一旦形成，就会被有效扩增。在用于引物设计的位点因为遗传元件的定位而受限时，如site-directed突变、表达克隆或用于DNA工程的遗传元件的构建和操作，热启动PCR尤为有效。????限制Taq DNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反应液，并将其置于预热的PCR仪。这种方法简单便宜，但并不能完成抑制酶的活性，因此并不能完全消除非特异性产物的扩增。???? 热启动PCR 　热启动通过抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到PCR仪达到变性温度。包括延缓加入Taq DNA聚合酶在内的大部分手工热启动方法十分烦琐，尤其是对高通量应用。其他的热启动方法使用蜡防护层将一种基本成分，如镁离子或酶，包裹起来，或者将反应成分，如模板和缓冲液，物理地隔离开。在热循环时，因蜡熔化而把各种成分释放出来并混合在一起。象手动热启动方法一样，蜡防护层法比较烦琐，易于污染，不适用于于高通量应用。????Platinum DNA聚合酶对于自动热启动PCR来说方便高效。Platinum Taq DNA聚合酶的成分为复合有抗Taq DNA聚合酶单克隆抗体的重组Taq DNA聚合酶。此酶在常温下活性被封闭，要在94℃－ 95℃下加热数分钟才能够恢复酶活性。同经化学修饰用于热启动的Taq DNA聚合酶相比，Platinum酶不需要在94℃延时保温（10到15分钟）以激活聚合酶。使用PlatinumTaq DNA聚合酶，在94℃进行2分钟就可以恢复90％的Taq DNA聚合酶活性。 热启动PCR Touch-down PCR又称降落PCR。即选定一个温度范围，如50—35 ℃ ，每降1-2 ℃进行1-2个循环，然后在50度下进行15个循环。 Touch-down的原理：随着退火温度的降低，特异性逐步降低，但特异性条带在温度较高时已经扩增出来，其浓度远远超过非特异性条带，随着退火温度的降低，特异性条带优先被扩增。 选择初始复性温度的原则：起始复性温度应该比引物的Tm值高出5-10度，然后每个循环递减1-2度 Touch-down PCR low copy of targeted DNA; high degree degeneracy (or less specific) of the first set of primers; RT-PCR using oligo-dT. Touch-down PCR的应用范围 RT-PCR 　RNA的多聚酶反应（RT-PCR）是以RNA 为模板，联合逆转录反应 （reverse transcription，RT）与PCR，可用于检测单个细胞或少数 细胞中少于10个拷贝的RNA模板。 　RNA扩增包括两个步骤： 在单引物的介导下和逆转录酶的催化下，合成RNA的互补cDNA 加热后cDNA与RNA链解离，然后与另一引物退火，并由DNA聚 合酶催化引物延伸生成双链靶DNA， 最后扩增靶DNA Double strand cDNA AAAAA TTTTT RT AAAAA TTTTT RT RT AAAAA TTTTT Oligo dT primer is bound to mRNA Reverse transcriptase (RT) copies first cDNA strand Reverse transcriptase digests and displaces mRNA and copies second strand of cDNA RT-PCR A. Double strand DNA B. Denature 96o 50o C. Anneal primers 50o D. Polymerase binds 72o Taq Taq RT-PCR cDNA第二链的合成方法有以下几种: 　　(1) 自身引导法 合成的单链cDNA 3端能够形成一短的发夹结构,这就为第二链的合成提供了现成的引物,当第一链合成反应产物的DNA:RNA杂交链变性