RQ-PCR技术的原理及临床应用幻灯片.pptVIP

溶解曲线 溶解曲线分析可以用来确定不同的反应产物，包括非特异性产物。扩增反应完成后，通过逐渐增加温度同时监测每一步的荧光信号来产生溶解曲线，随着反应中双链DNA变性，荧光染料又回复到游离状态导致荧光信号降低，用荧光信号改变的负的一次倒数与温度作图，在扩增产物的溶解温度上有一特征峰（Tm，DNA双链解链50％的温度），用这个特征峰就可以将特异产物与其它产物如引物二聚体区分开，因为它们在不同的温度溶解. 荧光定量PCR在病原体检测中的应用 一 肝炎病毒定量检测 二 性病病原体检测 三 结核杆菌及呼吸道病原体检测 四 优生优育(TORCH)相关项目检测 （二） HBV-DNA与“两对半” 3. 血清学指标(－)不能排除HBV感染。 (1)HBV基因变异，如S区和前S区的变异，可影响HBsAg的表达或改变其抗原性； (2)HBV-DNA基因重排：HBV-DNA基因整合到宿主染色体中，可导致DNA序列重排，进而影响HBsAg表达。 (3)患者因素：患者处于HBV感染的恢复早期，体内HBsAg水平很低，或患者体内存在长期的低水平HBV复制，采用普通的酶联免疫吸附试验不能检出。 (4)HBsAg免疫复合物的形成：免疫复合物中的抗体封闭复合物内抗原，试剂中抗体不能与复合体内抗原结合，从而致HBsAg假阴性结果。 二 常见性传播疾病病原体 一　淋球菌（NGH） 二　沙眼衣原体（ CT ） 三　解脲脲原体（UU） 四　梅毒螺旋体（TP） 五　单纯庖疹病毒（HSV） 六　乳头瘤病毒（HPV） 七　人类免疫缺陷病毒（HIV） 八 EV71 A16 通用型 荧光定量PCR诊断NGH/CT/UU的意义 1. 非培养或形态学检查的诊断技术，快速、特异、敏感。 2. 对无症状或症状轻者，可以早期确诊。 3. 对NGH、CT、UU 等混合感染者，诊断和鉴别诊断。 4. 指导用药、考核疗效。 谢谢！ * * 实时荧光定量PCR技术的原理 (Real time Quantitative PCR) 吴智明 实时荧光定量PCR定义： 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实现了实时监测整个PCR进程，对起始模板进行定量分析的方法。 与普通PCR的区别 普通PCR技术： 在PCR结束后对终点产物进行定量分析。 实时定量PCR技术： 实时检测PCR扩增，在扩增的指数期对起 始模板进行定量。 荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，一般荧光阈值的设置是 基线（背景）荧光信号的标准偏差的 10 倍。 每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数被称为 CT 值（ threshold value ）。 荧光定量PCR化学原理 非特异性荧光标记： 1、SYBR Green 特异性荧光标记： 2、TaqMan 1、SYBR Green 法 SYBR Green 熔解曲线分析 SYBR Green法优缺点 优点: 对DNA模板没有选择性 适用于任何DNA?? 使用方便--不必设计复杂探针?? 非常灵敏?? 便宜 2、TaqMan探针法 TaqMan作用机理 TaqMan法优缺点 Real-time PCR 临床应用 临床应用 HBV （二） HBV-DNA与“两对半” 1. “两对半” ：机体的免疫反应状态； 2. “携带者”、“大三阳”、“小三阳”等免疫学指标不能 反应体内病毒复制水平与感染程度。 FQ-PCR：检测的是HBV本身的遗传物质—DNA，是 病毒存在和复制的最可靠、最直接的指标。 HBV HBsAg(－)　 HBV-DNA(＋) 　　　　 　 HBeAg (－) HBV-DNA(＋) 4. 也可能出现HBsAg(＋)，HBV-DNA(－)。 5. HBsAb (＋) 、 HBcAb (＋) 、 HBeAb (＋)三抗体阳性 与HBV DNA 2.5× 103 copy /ml 结果解释。 HBV (三)　HBV-DNA定量检测的临床意义 3. HBV-DNA定量与预后 　　　 a. 含量高者急性肝炎患者易慢性化 　　　 b. 癌变的几率明显高于含量低者 1. HBV-DNA定量与HBV复制水平及传染性 2. HBV-DNA定量与乙肝药物疗效 　 a. 专家提出103 copy /ml做为阴性