第七章 PCR技术-LXG-2005-4幻灯片.pptVIP

DNA模板变性 (denature)： 95℃左右高温使模板DNA完全变性 单链DNA模板与引物退火 (annealing)： 引物与模板形成复合物的几率DNA分子自身的复性 引物的延伸 (extension)： DNA聚合酶在最适温度下催化DNA合成反应 PCR技术的特点 高度的敏感性：是最主要的特点，25个循环可扩增106倍，它可对单拷贝、单根头发、一滴血等微量标本进行分析 高度的特异性：取决于2个引物设计的好坏，依赖于引物与模板结合的正确性，退火温度 操作简便、快捷 适用样品的广泛性 第一节 PCR的反应体系 寡核苷酸引物 PCR反应缓冲液 耐热DNA聚合酶 dNTP 模板DNA PCR反应引物的常用浓度范围 PCR反应中引物的浓度是0.1～1μmol/L 在100μl中引物的量为25～100 pmol, 假如用25μmol/L浓度的引物贮备液只需加1～ 4μl 寡聚核苷酸引物溶液浓度的计算与配制 1 OD260= 33μg单链寡聚核苷酸(oligo) 5 OD260= 165μg Mw的计算: ① = nA×312+nC×288+nG ×328+nT×303-61 = 5×312+4×288+5×328+3×303-61=5200 ② = 碱基数×324.5(每个碱基的平均Mw) = 17×324.5=5516.5 25μmol/L= Y(μl) = =1269 二、PCR反应缓冲液 Tris-Cl（pH 8.3～8.8) KCl(50mmol/L)或(NH4)2SO4(25mmol/L):促使引物退火 MgCl2(25mmol/L):影响酶活与精确度,产物的特异性 明胶(5%)或BSA或Tween-20:稳定酶活性 甲酰胺(5%):使引物与模板特异性配对 三 、耐热DNA聚合酶 必需金属离子 Mg2+ Mg2+ Mg2+ Mg2+ 3 →5外切活性 － － ＋ ＋ 5→3外切活性 ＋ ＋ ＋ ＋ 逆转录活性 ＋(Mn2+) ＋(Mn2+) 未定 未定 耐受100℃ － － ＋ ＋ Taq DNA聚合酶的种类 天然酶---嗜热水生菌分离纯化 基因工程酶---Amlpi TaqTM 四、dNTP dNTP是dATP，dCTP，dGTP，dTTP的总称 dNTP在50次循环中是稳定的 dNTP在PCR中的常用浓度是20～200μmol/L 试剂公司已将其pH调至7.0 ～7.5 要避免反复冻融, 分装冻存于-20℃ 每种贮存液浓度为5 ～10mmol/L, 一般为10 mmol/L, 4种合并后浓度即为2.5 mmol/L 100μl的PCR反应中, 假如用各2.5 mmol/L浓度的dNTP混合液贮备液只需加0.8～8μl 注意Mg2+浓度与dNTP浓度之间的关系 五、模板DNA 来源：广泛 要求：待扩增部分需部分纯化 用量：ng量的克隆DNA，μg水平的染色体DNA 抽提方法：简单的水煮沸法 去垢剂裂解细胞→蛋白酶消化蛋白→有机溶剂抽提→乙醇沉淀核酸 扩增产物长度：检测性的长度一般为500bp (100 ～ 300bp为好)；克隆片段则不受此影响 引物长度在15～30个碱基，人基因组有3×109bp，19bp引物：419=2.75 ×1011中重复1次. 引物的碱基的分布是随机的, 避免5个以上的嘌啶和嘧啶的连续排列, 尤其3 不应有连续3个G或C 避免两引物间的互补,特别是3 端 引物自身不应有连续超过3个bp的互补序列 引物的3 端不能有任何修饰, 3 决定产物的特异性 引物的5 端限定PCR产物的长度, 5 端可进行修饰 引物与非扩增序列同源性应70%或连续8个互补 扩增编码区中,引物3 端不要终止于密码子的第3位 第三节 PCR