第三章细胞生物学研究方法.pptVIP

（二）荧光显微镜技术 （Fluorescence Microscopy） ?原理与应用 ? 荧光素直接标记技术 ? 免疫荧光标记技术 ? 在光镜水平用于特异蛋白质等生物大分子 的定性定位研究： 如绿色荧光蛋白(GFP)的应用 喷镀技术：是电子显微镜中一种重要的增强背景和待观察样品反差的方法。 SEM：扫描电子显微镜 STEM：扫描透射电子显微镜 STM：扫描隧道显微镜 AFM：原子力显微镜是在STM基础上的一种显微镜。 X射线衍射技术： STM的主要装置包括实现X、Y、Z三个方向扫描的压电陶瓷、逼近装置、电子学反馈控制系统和数据采集、处理显示系统。 STM的主要特点；1.具有原子尺度的高分辨率。侧分辨率0.1-0.2nm，纵分辨率0.001nm；2.可以在真空、大气、液体等多种条件下工作。3.非破坏性测量。与其功能相似的还有原子力显微镜等十于种。 第二节 细胞组分的分析方法 一、用超速离心技术分离细胞器与生物大分子及其复合物 1.离心分离技术（1）速度离心分离（差速离心、移动区带离心也称密度梯度离心）（2）等密度离心技术 2.层析分离技术：层析是广泛应用分离蛋白质的方法，根据蛋白质的形态、大小和电荷的不同而设计的物理分离方法。基本特点：有一个固定相和流动相。 （1）凝胶过滤层析：又称排阻层析或分子筛法，根据蛋白质的大小和形状，即蛋白质的质量进行分离和纯化。葡萄糖或琼脂糖。 （2）离子交换层析：根据蛋白质所带电荷进行分离和纯化。（3）亲和层析：生物分子中的特定部位能够同其他分子相互识别结合，如酶与底物、抗体与抗原的识别结合，结合是特异的、可逆的。 二、细胞内核酸、蛋白质、酶、糖类与脂质等的显示方法 第三节细胞培养、细胞工程与显微操作技术 一、细胞培养 1.动物细胞培养 （1）原代细胞：1-10代从机体取出后立即培养的细胞。 （2）继代细胞（传代细胞）-细胞株40-50代 （3）细胞系：无限分裂、无接触抑制的传代细胞。 分为两种基本形态：成纤维样细胞、上皮样细胞。可移动的游走细胞。 2.植物细胞培养 （1）单倍体细胞培养 （2）原生质体培养：植物体细胞用纤维素酶去壁的细胞称原生质体。 第四节 用于细胞生物学研究 的 模式生物 模式生物：具有个体较小，容易培养，操作简单，生长繁殖快的特点 常用的模式生物：病毒、细菌、黏菌、海胆、线虫、果蝇、斑马鱼小鼠等 5. 扫描电子显微镜技术（SEM） * 第三章 细胞生物学研究方法 ? 细胞形态结构的观察方法 ? 细胞组分的分析方法 ? 细胞培养、细胞工程与显微操作技术 第一节 细胞形态结构的观察方法 ? 光学显微镜技术（light microscopy） ? 电子显微镜技术 (Electron microscopy) ? 扫描遂道显微镜 (scanning tunneling microscope ） 一、光学显微镜技术 ? 普通复式光学显微镜技术 ? 荧光显微镜技术（FM） ? 激光共焦扫描显微镜技术（LCM） ? 相差显微镜（phase-contrast microscope） ? 微分干涉显微镜（DIM） ? 暗视野和倒置显微镜 分辨率：指区分开两个质点间的最小距离。光学显微镜的 最小分辨率为0.2um，电子显微镜的最小分辨率为0.2nm。 （一） 普通复式光学显微镜技术 组成：光学放大系统：目镜和物镜 照明系统：光源、折光镜、聚光镜和滤光片 机械和支架系统 性能参数：分辨率（区分开两支点间的最小距离） （三） 激光共焦点扫描电镜技术 （laser scanning confocal microscopy） 共焦点：是指物镜和聚光镜聚焦在同一个点上。 应用：排除焦平面以外光的干扰，增强图像反差和提高分辨率(1.4—1.7)，可重构样品的三维结构。 （四）相差和微分干涉显微镜技术 原理：光线通过不同密度的物质，滞留程度不同， 密度大，滞留的时间长，否则时间短，从而产生 光程差(相位差)，显微镜可以把这种光程差转换为 振幅差。 反差的产生：以样品种不同部位的密度差别为基础， 产生通过光程差，通过物镜后面的差相板来夸大相 位差，从而造成人眼可见的明暗区别。 1. 相差显微镜（phase－contrast microscope） 特点和应用：不需要染色，可观察活细胞、细胞 核、线粒体等细胞器的动态。在医学和生物学方 面应用广泛，如血液的观察，脓汁、分泌物的观 察，细胞癌变得早期诊断，细胞的运动、细胞分 裂现象的观察