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第三章 荧光分光光度法 ( Fluorescence Spectrophotometry ) 前言： 1852年，斯托克斯（Stokes）发现了萤石在暗处受到光的照射时，会发出一种蓝白色的光，他把这种光命名为“萤光”。 1868年 ，Goppelstroeder 发表了利用Al-桑色素的绿色荧光来分析微量Al的分析方法，可见荧光分析法是一种历史悠久的分析方法。 时至今日，荧光分析在方法上取得了极大的进展。 促进了诸如：时间分辨、相分辨、荧光偏振、荧光免疫和同步荧光等荧光分析新方法的发展，同时促使各种各样新型荧光分析仪器的出现。 在仪器方面，微机控制的全自动荧光分析仪具有灵敏度高（比紫外-可见分光光度法高2 - 3个数量级）、选择性好、工作曲线线性范围宽且能提供激发光谱、发射光谱、发光强度、发光寿命、量子产率、偏振和各向异性诸多信息等优点，已成为一种重要的痕量分析技术。 在生物、医药、环境和石油工业等诸多领域，荧光分析法都有广泛的应用。不仅能直接或间接地分析众多的有机化合物，而且还能利用与有机试剂间的反应进行许多无机元素的测定。 随着科技的发展进步，荧光这种光致发光（photoluminescence）的本质被进一步揭开。 物质除了受紫外-可见光照射后会发出紫外和可见（UV-Vis）荧光之外，受其它各种不同波长光的照射之后，同样也有发光现象。例如：X-荧光、红外荧光等。 除了吸收光能使分子受激发而发光，根据起始激发形成的方式，可以将荧光同其它的发光类型（例如：生物发光、热发光、化学发光和摩擦发光）区别开来。 通过化学反应使分子受激而发光称为“化学发光”。利用化学发光进行分析工作叫“化学发光分析”。 化学发光分析、荧光分析和磷光分析统称为“分子发光分析（molecular luminescence）”。 荧光和磷光同属光致发光。通过测定发光的强度可以定量测定许多种痕量的无机物和有机物。 相对于磷光和化学发光而言，目前荧光法的应用较多。 本章主要讨论荧光分析法。 ?3.1 分子荧光产生的本质(Molecular Fluorescence) 图3-1 吸收光谱和荧光光谱能级跃迁示意图 1.产生荧光的原因 荧光物质的分子吸收了特征频率的光能后，由基态跃迁到能级较高的第一电子激发态或第二电子激发态，然后通过无辐射跃迁返回到第一电子激发态的最低振动能级上，再从该能级降落至基态的各个不同的振动能级上，同时释放出相应能量的分子荧光，最后以无辐射跃迁形式回到基态的最低振动能级。 需要注意的是： （1）整个过程是在单线态之间进行的； （2）产生荧光的过程极快，约在10-8 秒左右 内完成； （3）荧光的产生是从第一电子激发态的最低振动能级开始，而与荧光物质分子被激发至哪一个能级无关。 因此，荧光光谱的形状和激发光的波长无关。 2. 磷光（Phosphorescence） 当某些物质分子被激发到较高的能级，并通过无辐射跃迁降落至第一电子激发态的最低振动能级之后，尚不能继续直接降落至基态，而是通过另一次无辐射跃迁降至一个中间的亚稳态能级—三重线态上，这些分子在三重线态上经短暂停留后，再降落至基态的各个不同的振动能级上，同时发出辐射光，称这种发出的辐射光为磷光。 磷光与荧光的区别主要为： (1) 产生磷光的过程稍长，约在10-5~0.1 秒，有时长达1 秒以上； (2) 在辐射停止几秒或更长一段时间后，仍能检测到磷光；而上述荧光现象在照射光一旦停止照射，荧光便立即消失。 3. 迟滞荧光（延迟荧光） 　 某些分子在跃迁至三重线态之后，通过热激活作用，可以再回升至第一电子激发态的各振动能级上，然后再由第一电子激发态的最低振动能级（v=0）降落至基态的各个不同振动能级而发出荧光，这种光叫做迟滞荧光（或延迟荧光）。 ４. 分子吸收光谱与分子荧光光谱的关系 　 分子吸收光谱和分子荧光光谱都是分子内部振动能级结构的反映，但是分子吸收光谱是反映电子激发态中各个振动能级结构情况。 在大多数分子中，由于电子激发态和电子基态的各个振动能级结构相似，因此吸收光谱和荧光光谱往往呈现大致的镜像对称关系。 ?3.2 荧光与物质分子结构之间的关系 １. 物质产生荧光的两个必须条件 （1）物质分子必须具有能吸收一定频率光的特征结构； （2）物质分子在吸收了特征频率的辐射能之后，必须具有高的荧光率，即具有较高的荧光效率（fluorescence efficiency）。